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第一部分ASAN小鼠脂肪组织中Nrf2对糖脂及能量代谢影响的研究目的脂肪组织(adipose tissue,AT)分为白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)。WAT主要分为皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)和脏器脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT)两大类。近年来的研究表明,脂肪组织的大量堆积与血管衰老、动脉粥样硬化的发生以及人体内的糖脂和能量代谢有着密切的联系。人体衰老通常伴随着体脂的再分配,但在该过程中,AT具体转化的研究尚待深入。脂肪组织与氧化应激有着密切的联系,在氧化应激致衰老的理论体系中,nuclear factor erythroid-2-related factor(Nrf2)起着核心的作用。同时,大量的研究也表明,Nrf2在糖脂和能量代谢中也发挥着重要作用。而肝脏是糖脂代谢的主要靶点,同时肝细胞在维持血糖稳态中起着重要作用。因此,本研究旨在探讨Nrf2及其调控的下游抗氧化应激分子在敲除Nrf2的转基因小鼠模型中WAT向BAT的转化及抵抗衰老,和对糖脂及能量代谢相关因子表达作用的研究。方法选取两个半月龄的NF小鼠作为对照组和ASAN(脂肪细胞中特异性敲除Nrf2)小鼠作为实验组各8只,同时给予高脂饮食喂养。四个月后,于处死前一天进行8小时的饥饿处理,对小鼠进行腹腔葡萄糖耐量测定实验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT),时间点为(Oh,1/2h,1h,2h);之后采取颈椎脱臼的方法处死小鼠,分别提取两组小鼠体内的VAT、SAT和肝脏组织,使用Western-blot及qPCR等技术检测小鼠脂肪组织内:1,BAT标记基因(PGC-1α,PRDM16,Dio2)的表达;2,线粒体的生成(UCP1,Cycs);3,WAT 标记基因(Bmp4,Rb1,Resistin)的表达;4,FGF21相关的代谢信号通路相关因子(FGF21,AMPKα、Sirt1、PGC-1α和UCP1)的表达;另一方面,使用Western-blot和qPCR的方法等技术检测两组小鼠肝脏组织中:1,内质网应激(p-EIF2α和EIF-2α等)和总炎症状态相关的因子(IL-β、TNF-α、NF-kB、p-p65、MMP2和MMP9)的表达;2,糖代谢相关蛋白的表达情况(Giut-4、IGF-1R、FOXO1、p-AKT 和 p-GSK3α/β)。结果与NF小鼠相比,ASAN转基因小鼠的血糖升高,且ASAN小鼠的AT中:1,BAT的标记基因PGC-1α,PRDM16和Dio2等表达增加(P<0.05);2,线粒体生成基因,UCP1和Cycs的表达显著增加(P<0.05);3,WAT标记基因:Rb1,Bmp4和Resistin的表达降低;4,UCP1和Sirt1参与的长寿基因信号通路的表达增加;5,FGF21相关的代谢信号通路相关因子(FGF21、p-AMPKα、Sirt1、PGC-1α和UCP1)等表达增加。同时,与NF小鼠相比,ASAN转基因小鼠肝脏组织中:1,内质网应激相关因子(p-EIF2α)和总炎症状态相关因子(IL-β、TNF-α和p-NF-kB)的表达降低;2,糖代谢相关蛋白(Giut-4、IGF-1R、FOXO1、p-AKT 和 p-GSK3α/β)表达降低。结论在特异性敲除Nrf2的ASAN转基因小鼠模型中,Nrf2参与了 WAT向BAT的转化及抵抗衰老,同时抑制FGF21信号通路的表达,参与调节糖脂及能量代谢。第二部分3T3L1细胞和AML12细胞中特异性沉默Nrf2对代谢影响的研究目的从细胞水平探讨在3T3-L1前脂肪细胞和AML12细胞中特异性沉默Nrf2对脂肪转化相关的影响和糖脂及能量代谢相关因子的表达情况研究。方法①培养3T3-L1前脂肪细胞,通过诱导使其转化成脂肪细胞;使用Nrf2的siRNA感染上述脂肪细胞,获得细胞内Nrf2被敲除的脂肪细胞。在上述脂肪细胞内检测因Nrf2表达水平的变化而引起的改变:1、应用Western-blot和qPCR技术检测WAT、BAT、线粒体生成等标记基因的表达水平的变化,以及UCP1和Sirt1参与的长寿基因信号通路;2、应用葡萄糖检测试剂盒检测脂肪细胞对葡萄糖摄取能力的变化。②同时培养AML12细胞,使用Nrf2的siRNA感染上述细胞,获得细胞内Nrf2被敲除的AML12细胞。利用葡萄糖摄取试剂盒检测,沉默Nrf2后细胞对葡萄萄摄取能力的改变。另外给予高糖(33mmol/L)对AML12细胞进行干预,分为对照+低糖组(Control+ Low Glucose,Con + LG),对照+高糖组(Control + High Glucose,Con+HG),Nrf2-Knock down + 低糖组(Nrf2-Knock down + Low Glucose,NK + LG),Nrf2-Knock down + 高糖组(Nrf2-Knock down + High Glucose,NK + HG)。通过 Western-blot 和qPCR的方法来检测:1,内质网和抗氧化应激相关因子(p-EIF2α、EIF-2α、HO-1和NQO1)的表达;2,总炎症状态相关的因子(IL-β、TNF-α、NF-kB、p-p65、MMP2和MMP9)的表达;3,FGF21相关的代谢信号通路相关因子(FGF21,AMPKα、Sirt1、PGC-1α 和 UCP1)的表达;4,糖代谢相关蛋白(Giut-4、IGF-1R、FOXO1、p-AKT和p-GSK3α/β)的表达情况。结果①在脂肪细胞中,与对照组相比,Nrf2沉默组,Nrf2的mRNA和蛋白水平分别降低约90%和75%,Nrf2下游抗氧化酶NQO1和HO1表达也显著下降;同时:1,BAT的标记基因PGC-1α,Dio2和PRDM16等的表达升高(P<0.05);2,线粒体生成基因,UCP1和Cycs的表达显著增加;3,WAT表达的标记基因,Rb1,Bmp4和Resistin表达降低;4,参与的长寿基因信号通路的AMPKα,Sirt1和PGC-1α的表达均增加。同时,在Nrf2沉默组,葡萄糖吸收也增加。②在AML12细胞中,与对照组相比,Nrf2沉默组,Nrf2的mRNA水平和蛋白水平分别降低约90%和70%,Nrf2下游抗氧化酶NQO1和HO1表达也显著降低;同时,1、内质网应激相关因子(p-EIF2α)表达增加和抗氧化应激相关因子(HO-1和NQO1等)表达降低;2、总炎症状态相关的因子(IL-β、TNF-α、NF-kB、p-p65、MMP2 和 MMP9)表达增加;3、FGF21 相关的代谢信号通路相关因子(FGF21,AMPKα、Sirt1、PGC-1α和UCP1等)表达增加;4、糖代谢相关蛋白(Giut-4、IGF-1R、FOXO1、p-AKT 和 p-GSK3α/β)的表达降低。5、葡萄糖摄取能力明显增加。结论在离体条件下的脂肪细胞中,Nrf2沉默后使得BAT表达基因增加,WAT表达基因降低,增加线粒体生成及参与长寿基因信号通路的UCP1和Sirt1的表达;增强了脂肪细胞对葡萄糖摄取的能力。在AML12细胞中,Nrf2沉默后内质网应激,总炎症状态,FGF21相关代谢和糖代谢增强,抗氧化应激能力降低;增加了对葡萄糖摄取能力。