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羊绒的生长具有周期性特点,每年都会经历由休止期(四至六月份)向生长期(七月份至次年二月份)的周期性转变。前期对陕北白绒山羊羊绒生长期和休止期皮肤样品的RNA-Seq结果显示,作为转录因子Hox家族的一员,Hoxc13和许多角蛋白如 KRT38、KRT84 在两个时期的表达趋势相同,它们均在羊绒生长期高表达,而休止期低表达。然而,也有部分角蛋白如KRT1、KRT2与Hoxc13在两个生长时期的表达趋势相反。值得注意的是,在这些角蛋白基因启动子区域均发现转录因子Hoxc13潜在的结合位点。这与之前报道的Hoxc13对下游角蛋白和角蛋白关联蛋白的调控方式不一致。 为了研究Hoxc13在陕北白绒山羊羊绒周期生长过程中对角蛋白家族相关基因的调控机制,我们首先通过SSA修复的方式构建了陕北白绒山羊Hoxc13基因表达载体,并克隆了陕北白绒山羊角蛋白KRT1、KRT2、KRT38、KRT84基因的启动子,通过在毛乳头细胞中过表达Hoxc13基因的方法,来研究Hoxc13对角蛋白基因转录的影响。同时,为完善Hoxc13调控角蛋白家族相关基因的分子机制,通过双荧光素酶和酵母双杂交的方法检测了陕北白绒山羊Hoxc13与Foxn1两种转录因子之间是否存在互作,获得了以下结果: 1、通过构建重复序列长度分别为42 bp、101 bp和333 bp的Hoxc13中间表达载体,将其线性化后利用大肠杆菌 SSA 修复的方式构建了陕北白绒山羊Hoxc13基因表达载体。此外,用同样的方法采用了25bp的正向重复序列构建了单个碱基突变(c.812A>G)的Hoxc13基因表达载体。 2、在陕北白绒山羊毛乳头细胞中过表达Hoxc13 基因后,角蛋白 KRT38、KRT84基因启动子的转录活性显著增强(P<0.05);角蛋白KRT1基因启动子的转录活性显著降低(P<0.05);角蛋白 KRT2 基因启动子的转录活性变化差异不显著(P>0.05)。 3、在陕北白绒山羊毛乳头细胞中过表达Hoxc13和Foxn1 基因后,KRT84基因启动子的转录活性显著高于单表达Hoxc13或Foxn1基因组(P<0.05);酵母双杂交结果显示,陕北白绒山羊Hoxc13与Foxn1酵母融合表达载体共同转化到 AH109后,3个单克隆都有蓝色底物生成,而Hoxc13基因和Gal4 BD融合表达的诱饵载体(pBD-Hoxc13)转化到酵母 AH109 后,单克隆没有蓝色底物生成,表明Hoxc13和Foxn1存在相互作用。 我们的研究结果进一步揭示了陕北白绒山羊Hoxc13基因对角蛋白转录调控的分子机制,阐明Hoxc13在调控陕北白绒山羊羊绒周期生长中的作用。为揭示陕北白绒山羊在羊绒周期性生长中的具体调控机制提供依据。