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一、研究背景与目的研究发现miRNA的表达异常与多种肿瘤的发生、发展相关,miRNA可能成为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。本研究基于前期Solexa高通量测序及miRDeep2软件预测的结果,对候选新miRNA进行了二级结构预测及实验验证,评估候选新miRNA与食管癌的发病风险,进一步评价它们的生物学功能,初步探讨可能的调控机制,为寻找潜在的肿瘤标志物及其临床应用提供基础数据支持。二、研究方法与结果(一)食管癌相关候选新miRNA的鉴定及与食管癌的发病风险研究基于前期对食管癌细胞RNA的Solexa高通量测序和miRDeep2软件预测的结果,选择了miRDeep2软件评分最高的4个候选新miRNA,使用sflod在线预测网站分析候选新miRNA前体序列的二级结构,结果显示4个候选新miRNA的前体序列都能以较低的自由能形成茎环结构,且成熟体序列分别位于茎环的3’及5’臂上。使用荧光定量PCR检测候选新miRNA在食管癌细胞及食管上皮细胞中的表达情况,结果显示novel-miR-4885、novel-miR-13894、novel-miR-21009均能在食管癌细胞及食管上皮细胞中稳定表达,novel-miR-7121仅在食管癌细胞中表达,扩增曲线平行性较好,熔解曲线峰形单一。对荧光定量PCR产物进行TA克隆测序,结果显示测序峰图波形单一,无杂峰,4个候选新miRNA的荧光定量PCR产物均与生物信息学预测的miRNA成熟体序列完全一致。招募淮安市第一人民医院2009~2012年经病理或内镜诊断明确的食管癌患者126例。使用荧光定量PCR检测候选新miRNA在食管癌及癌旁组织中的表达情况,结果显示,与癌旁组织相比,novel-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-21009在食管癌组织中显著高表达(P<0.05),相对表达量分别是对照组的1.77、1.38、1.91倍;而novel-miR-13894在食管癌组织和癌旁组织中的表达无统计学差异(P>0.05)。对数据进行条件logistic回归分析,结果显示,novel-miR-4885、novel-miR-7121、novelmiR-21009表达的升高能显著增加食管癌的发病风险(P<0.05),而novel-miR-13894表达的升高不影响食管癌的发病风险(P>0.05)。(二)候选新miRNA的生物学功能研究通过miRNA mimic转染EC109细胞,获得novel miRNA的过表达细胞模型,分别检测候选新miRNA对细胞周期、凋亡、增殖、迁移、侵袭的影响。(1)使用流式细胞术检测miRNA mimic转染48h后的EC109细胞的周期分布,结果显示novel-miR-4885转染组和对照组G1期、S期、G2期所占比例分别为(52.33±0.83)%vs(50.43±0.81)%、(28.80±0.50)%vs(25.98±0.34)%、(18.87±1.26)%vs(23.59±0.93)%;novel-miR-7121转染组和对照组G1期、S期、G2期所占比例分别为(49.80±1.69)%vs(44.76±1.11)%、(29.77±0.49)%vs(32.77±0.32)%、(20.43±1.50)%vs(22.48±1.05)%;novel-miR-13894转染组和对照组G1期、S期、G2期所占比例分别为(49.49±1.48)%vs(49.70±0.92)%、(31.35±1.57)%vs(30.78±0.78)%、(19.36±0.52)%vs(19.51±0.92)%;novel-miR-21009转染组和对照组G1期、S期、G2期所占比例分别为(56.55±1.70)%vs(50.43±0.81)%、(29.16±1.02)%vs(25.98±0.34)%、(14.29±0.68)%vs(23.59±0.93)%。novel-miR-4885和novel-miR-21009转染组G1期、S期比例显著高于对照组(P<0.05);novel-miR-7121转染组G1期比例显著高于对照组(P<0.05),S期比例显著低于对照组(P<0.05);novel-miR-13894转染组的周期分布与对照组无统计学差异(P>0.05)。(2)使用流式细胞术检测miRNA mimic转染48h后的EC109细胞的凋亡情况,novel-miR-4885转染组与对照组的早期凋亡率分别为(10.30±1.01)%vs(5.57±1.17)%;novel-miR-7121转染组与对照组的早期凋亡率分别为(7.35±0.35)%vs(7.90±2.69)%;novel-miR-13894转染组与对照组的早期凋亡率分别为(5.90±1.04)%vs(5.83±1.91)%;novel-miR-21009转染组与对照组的早期凋亡率分别为(8.70±0.78)%vs(5.57±1.17)%。可见novel-miR-4885和novel-miR-21009转染组细胞早期凋亡率显著高于对照组(P<0.05),而novel-miR-7121、novel-miR-13894转染组与对照组细胞的早期凋亡率无统计学差异(P>0.05)。(3)通过EdU染色成像法检测miRNA mimic转染后EC109细胞的增殖情况,novel-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-13894、novel-miR-21009的增殖率分别为(37.25±4.09)%、(31.32±3.53)%、(31.25±1.21)%、(30.71±4.25)%,与对照组(31.36±2.98)%相比,novel-miR-4885转染组的细胞增殖率显著升高(P<0.05),而novel-miR-7121、novel-miR-13894、novel-miR-21009转染组细胞增殖率与对照组无统计学差异(P>0.05)。(4)使用Transwell小室检测miRNA mimic转染后EC109细胞的迁移能力,novle-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-13894、novel-miR-21009转染组穿膜细胞数分别为31.60±3.89、35.60±5.02、37.40±3.92、36.80±5.37,与对照组19.90±4.72相比,均显著增加(P<0.05)。(5)使用Transwell小室检测miRNA mimic转染后EC109细胞的侵袭能力,novle-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-13894、novel-miR-21009转染组穿膜细胞数分别为45.60±6.36、29.87±7.40、25.00±3.20、34.30±7.36,与对照组19.50±5.36相比,均显著增加(P<0.05)。(三)候选新miRNA促进食管癌细胞迁移、侵袭的机制初探使用novel-miR-4885 mimic转染EC109细胞,获得novel-miR-4885的过表达细胞模型,检测novel-miR-4885转染组候选靶基因mRNA及蛋白的表达水平以及与候选靶基因3’UTR的结合情况,最后检测novel-miR-4885转染组EMT相关蛋白的表达和细胞黏附能力的变化。(1)通过荧光定量PCR检测novel-miR-4885转染组迁移、侵袭相关的候选靶基因mRNA在RIP前后的表达水平,结果发现与对照组相比,novel-miR-4885转染组α-catenin mRNA的相对表达水平显著下降了89.8%(P<0.05);与对照组相比,novel-miR-4885转染组α-catenin蛋白表达水平显著下调了57.9%(P<0.05),与mRNA表达水平变化一致。RIP分析显示,novelmiR-4885转染组α-catenin mRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05),是对照组的2.87倍。(2)构建α-catenin 3’UTR载体,通过双荧光素酶报告基因实验验证novel-miR-4885与α-catenin 3’UTR的结合。结果显示pmirGLO-WT+novel-miR-4885 mimic组的相对荧光素酶活性显著降低,与pmirGLO-WT+mimic NC组相比下降了27.5%(P<0.05);当novel-miR-4885与α-catenin 3’UTR结合位点突变后,pmirGLO-MUT+novel-miR-4885 mimic组与pmirGLOMUT+mimic NC组之间的相对荧光素酶活性无明显差异(P>0.05)。(3)通过Western Blot检测novel-miR-4885转染组EMT相关蛋白ZO-1、N-cadherin、E-cadherin、b-catenin的表达水平,结果显示,novel-miR-4885转染组与对照组ZO-1、N-cadherin、E-cadherin、b-catenin蛋白的相对表达量依次为(0.45±0.12 vs 0.92±0.11)、(0.82±0.06 vs0.51±0.05)、(0.59±0.03 vs 0.93±0.03)、(0.82±0.04 vs 0.54±0.07)。与对照组相比,novel-miR-4885转染组ZO-1和E-cadherin蛋白分别显著下调了51.6%和37.2%(P<0.05);而N-cadherin和b-catenin蛋白分别显著上调了66.7%和51.9%(P<0.05)。(4)通过细胞黏附实验评价novel-miR-4885转染组和对照组细胞的黏附能力。结果显示novel-miR-4885转染组和对照组的吸光度分别为(1.12±0.09)、(1.78±0.02),novel-miR-4885转染组的吸光度下降了37.1%(P<0.05)。三、研究结论:(1)从荧光定量PCR和TA克隆实验初步证实novel-miR-4885、novel-miR-7121、novelmiR-21009为食管癌相关新miRNA,novel-miR-13894为新miRNA。(2)novel-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-21009表达的升高能显著增加食管癌的发病风险,是食管癌的危险因素。(3)novel-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-21009能影响食管癌细胞周期分布;novel-miR-4885和novel-miR-21009能诱导食管癌细胞早期凋亡;novel-miR-4885能促进食管癌细胞增殖;novel-miR-4885、novel-miR-7121、novel-miR-13894、novel-miR-21009能促进食管癌细胞迁移和侵袭。(4)α-catenin是novel-miR-4885的功能性靶基因;novel-miR-4885可通过靶向调节α-catenin减弱食管癌细胞黏附能力进而在一定程度上促进食管癌细胞EMT,导致食管癌细胞的迁移侵袭能力增强。