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研究背景:原发性肝癌是一种严重威胁我国人民生命和健康的恶性肿瘤。NK细胞是固有免疫的重要组成部分,在抗肿瘤免疫中发挥重要作用,但NK细胞在肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）晚期患者的肿瘤组织中往往表现为比例下降,功能异常,了解NK细胞在肝癌患者中的表型,为恢复NK细胞在抗肝癌中的重要作用提供方向。B7-H3是B7免疫球蛋白超家族的一种I型跨膜蛋白,在早期研究中被认为可与未知受体结合协同刺激T细胞增殖,增强免疫系统活性,后续研究表明抑制急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞上B7-H3的表达或阻断B7-H3的活性,可显著增强NK细胞对AML细胞的细胞毒性。目前,B7-H3对T细胞、NK细胞等免疫细胞功能的影响仍存在争议,但关于实体瘤肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中NK细胞上B7-H3的表达情况及其对NK细胞自身免疫学功能影响的研究尚未见报道。研究目的:本文旨在探究肝癌患者NK细胞上B7-H3的表达特征及其对NK细胞增殖、凋亡、杀伤能力的影响和分子机制。研究方法:（1）收集肝血管瘤患者正常肝组织及外周血标本（对照组）,肝癌患者肿瘤组织及外周血标本（实验组）,通过流式细胞术分析上述各样本中CD45+CD3-CD56+NK细胞的比例及NK细胞上B7-H3的表达水平,并结合病理资料分析其临床意义。（2）通过免疫荧光技术分析肝癌患者肿瘤组织中CD56+细胞平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity,MFI）,以及 CD56+细胞和 B7-H3+细胞的重叠系数。（3）用慢病毒载体构建敲减B7-H3的NK92稳转细胞株。（4）用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）标记 NK92 细胞后,通过流式细胞术检测 B7-H3对NK92细胞增殖的影响。（5）通过流式细胞术检测B7-H3对NK92细胞凋亡的影响。（6）用CCK-8法检测B7-H3对NK92细胞杀伤人肝癌细胞株Huh-7和HepG2能力的影响。（7）用微量样本多指标流式蛋白定量技术（Cytometric Bead Array,CBA）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测 NK92 细胞与人肝癌细胞共培养时,B7-H3对NK92细胞分泌γ-干扰素（Interferon γ,IFN-γ）、穿孔素（pore-forming protein,Perforin）以及 Granzyme B 水平的影响。（8）用Western Blot分析B7-H3对NK92细胞p38/ERK及NF-κB等信号通路蛋白的影响。研究结果:（1）与对照组外周血相比,肝癌患者外周血白细胞中NK细胞的比例显著上升（P＜0.05）,两组NK细胞上B7-H3的表达差异没有统计学意义（P＞0.05）;与对照组正常肝组织相比,肝癌患者肿瘤浸润白细胞中NK细胞的比例显著下降（P＜0.05）,NK细胞的上B7-H3的表达显著上升（P＜0.05）。（2）与肿瘤直径小,淋巴结未转移,或TNM分期低的肝癌患者相比,肿瘤直径越大,淋巴结转移,或TNM分期更高的肝癌患者肿瘤浸润白细胞中NK细胞的比例更低（P＜0.05）;与肿瘤直径小,淋巴结未转移,或TNM分期低的肝癌患者相比,肿瘤直径越大,淋巴结转移,或TNM分期更高的肝癌患者肿瘤浸润白细胞中NK细胞上B7-H3的表达更高（P＜0.05）。肿瘤浸润白细胞中NK细胞的比例及NK细胞上B7-H3的表达情况在不同性别,不同年龄或不同甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP）表达情况的肝癌患者之间差异均没有统计学意义（P＞0.05）。（3）与对照组正常肝组织相比,肝癌患者肿瘤组织中CD56+细胞MFI显著下降（P＜0.05）,CD56+细胞和B7-H3+细胞的重叠系数显著上升（P＜0.05）。（4）用慢病毒成功构建敲减B7-H3的NK92稳转细胞株,与对照组（NC）相比,敲减B7-H3实验组（sh-B7-H3）NK92细胞增殖能力显著下降（P＜0.05）,凋亡差异没有统计学意义（P＞0.05）,杀伤Huh-7和HepG2的能力均显著下降（P＜0.05）,ERK1/2、p38、p65的磷酸化蛋白相对表达水平均显著下降（P＜0.05）。（5）和 Huh-7 共培养时,与 NC 组相比,sh-B7-H3 组 NK92 细胞 IFN-γ、Granzyme B分泌水平均显著下降（P＜0.05）,Perforin分泌水平显著上升（P＜0.05）;和HepG2共培养时,与 NC 组相比,sh-B7-H3 组 NK92 细胞 IFN-γ、Perforin、Granzyme B 分泌水平均显著下降（P＜0.05）。（6）与对照组（IgG2a）相比,加入B7-H3阻断型抗体实验组（MIH35）NK92细胞增殖能力显著下降（P＜0.05）,凋亡差异没有统计学意义（P＞0.05）,杀伤人肝癌细胞Huh-7和HepG2的能力均显著下降（P＜0.05）,ERK1/2、p38、p65的磷酸化蛋白相对表达水平均显著下降（P＜0.05）。（7）和 Huh-7 共培养时,与 IgG2a 组相比,MIH35 组 NK92 细胞 IFN-γ、Granzyme B分泌水平均显著下降（P＜0.05）,Perforin分泌水平显著上升（P＜0.05）;和HepG2共培养时,与 IgG2a 组相比,MIH35 组 NK92 细胞 IFN-γ、Perforin、Granzyme B 分泌水平均显著下降（P＜0.05）。研究结论:肝癌TME中各种分子的综合作用导致NK细胞在肿瘤浸润白细胞中的比例下降,功能受损,但高表达B7-H3的NK细胞群体表现出更强的增殖能力和肿瘤杀伤能力,提示B7-H3能促进NK细胞增殖,提高NK细胞的杀伤能力,高表达B7-H3的NK细胞可作为临床肝癌患者发挥高效抗肿瘤作用的标志细胞。