小麦白粉病是由小麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp. tritici)引起的世界性病害,严重影响小麦的产量,而与化学防治相比,培育和推广抗病品种是防治病害最经济有效且环保的措施。到目前为止,人们已经鉴定了60个抗白粉病基因或者位点,但是仅Pm3得到了成功的克隆。更多抗白粉病基因的克隆不但有助于小麦抗白粉病基因工程改良,也有助于深入了解小麦抗病的分子机制。普通小麦近缘物种提莫菲维小麦(Triticum timopheevii,2n=4x=28, AAGG)是重要的小麦抗白粉病抗源,其中Pm6基因已从提莫菲维小麦转移到普通小麦背景中,并且被广泛地应用于小麦抗白粉病育种。尽管Pmm6基因的毒性小种在很多地区已经出现,但是该基因在田间表现出很好的成株期抗性,尤其是与其他抗白粉病基因如Pm2联合使用抗性更为突出。成株抗性由于其抗性持久、抗谱广而越来越受到人们的重视,在小麦抗白粉病育种方面有较高的应用价值。为了更好地研究和利用Pm6基因,本研究在前期对Pm6基因初步定位的基础上,通过比较基因组学分析,开发基于麦类EST的STS标记和保守标记,精细定位Pm6基因,确定Pm6基因在模式植物中的共线区域,预测共线区域内的基因,确定并克隆Pm6的候选基因。本研究获得的主要结果如下：1.基于共线关系分析的分子标记开发和Pm6基因的精细定位在前人的研究中,Pm6基因定位在2BL FL 0.50-1.00的物理区域内,而模式植物水稻(Oryza sativa L.)和短柄草(Brachypodium distachyon)的基因组信息及大量的麦类EST资源为通过比较基因组学的方法开发标记对Pm6基因的精细定位提供了丰富的资源。因此,本研究,通过比较基因组学的方法首先将小麦定位在2BL FL 0.50-1.00物理区域内的所用EST序列与水稻基因组进行比较,找出与水稻第4染色体上的基因同源的小麦EST开发STS标记,在两个F2作图群体：IGVI-465/Prins(包含1816个单株)和IGVI-466/Prins(包含891个单株),对Pm6基因进行比较作图,筛选得到8个标记与Pm6基因紧密连锁(CINAU117、CINAU132、CINAU133、CINAU135、CINAU136、CINAU139、CINAU142和CINAU144)。在IGVI-466/Prins群体中将Pm6基因定位于两个STS标记CINAU117和CINAU139之间。进一步利用定位在Pm6两侧的8个STS标记对应的EST与模式植物水稻和短柄草的基因组进行比较分析,确定它们在两个基因组中的共线区域,以定位在两个基因组共线区域内的基因与麦类作物(主要包括普通六倍体小麦、一粒小麦、大麦、黑麦、燕麦、粗山羊草)的EST比对,搜索出同源的麦类EST,根据这些EST开发保守标记和COS(Conserved Orthologous Set)标记,从中筛选出11个保守标记和9个COS标记在抗、感亲本间表现多态,联合两个F2群体对Pm6基因进行精细定位,最终将共29个标记定位于Pm6基因所在的区域内。其中,在IGVI-466/Prins群体中总共有27个标记与Pm6基因连锁,14个标记与Pmm6基因共分离；在IGVI-465/Prins群体中共有15个标记与Pmm6基因连锁,最近的标记与Pm6的连锁距离为1.0 cM。根据所有连锁标记在两个群体中的比较作图,同时结合标记在水稻和短柄草基因组中定位分析,最终将Pm6基因界定在两个保守标记CINAU123和CINAU127之间。2.水稻和短柄草基因组中Pm6基因的共线区域分析、基因预测及候选基因的确定将29个与Pm6基因连锁的标记所对应的EST序列分别在水稻和短柄草基因组中进行序列比对搜索和定位,结果发现：29个EST中,89.6%和79.3%能够分别在短柄草的Bd5染色体长臂和水稻的第4染色体长臂上找到相应的同源基因,这些标记分布在短柄草Bd5染色体长臂大约5.6 Mb的区域内(从第21,159,780 bp到第26,682,408 bp之间)；在水稻第4染色体长臂上对应的区域大约6.0 Mb(从第27,802,151bp到第33,785,309 bp之间)。比较这些连锁标记在三个基因组中的排列顺序发现：在水稻和短柄草中这些标记的排列顺序具有很强的保守性,但在小麦与水稻或者小麦与短柄草的比较中均发现有基因重排的现象。对与Pm6基因连锁最紧密的两侧标记CINAU123和CINAU127之间的区域对应的水稻和短柄草基因组的同源区段进行基因预测和分析,发现在这个同源区域内存在一个含有抗病基因保守结构域的基因簇,即富含亮氨酸的类受体蛋白激酶基因簇(LRR-RLK),并将LRR-RLK基因簇确定为Pm6的候选同源基因。3.Pm6候选基因TaLRR-RLK的克隆为了在小麦中克隆LRR-RLK基因,对水稻和短柄草的LRR-RLK基因成员及其与之同源的麦类EST序列进行比较分析,根据该基因簇保守的外显子区域设计引物,首先从含Pm6基因的渐渗系IGVI-465中分离LRR-RLK基因的部分序列,然后根据这个序列设计RACE引物。通过RACE方法成功地从IGVI-465中克隆了小麦中LRR-RLK基因的全长序列(命名为TaLRR-RLK). TaLRR-RLK的全长ORF为3045 bp,编码1014个氨基酸；其编码的蛋白质在N端有一个信号肽,一个疏水的跨膜域,胞外有11个LRR重复基序,胞内有一个保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域。TaLRR-RLK与GFP融合蛋白的亚细胞定位结果表明,TaLRR-RLK主要定位在细胞核和细胞膜中。利用半定量RT-PCR和Q-PCR技术分析该基因在不同生育期及不同胁迫诱导下的表达特征,结果表明,该基因在IGVI-465的二叶期(感病阶段)到四叶期(抗病阶段)之间有明显的上调表达,与Pm6的抗性表型一致,而在感病亲本Prins的不同生育期中表达没有差异；TaLRR-RLK在抗、感亲本中均受到白粉菌的诱导上调表达；同时SA能够明显诱导该基因的表达,推测该基因可能通过SA介导的信号通路参与对白粉菌的抗性反应。4.Pm6基因附近一个保守的类受体蛋白激酶基因TaRPK的克隆在前人研究中,发现RFLP标记BCD135与Pm6紧密连锁,并且在水稻和大麦基因组的该标记位点附近同时存在两个保守的基因：一个编码未知功能的蛋白,纪剑辉(2008)利用大麦中该基因的序列成功开发了STS标记,并且该标记与Pm6紧密连锁；而另一个保守的基因是一个类受体蛋白激酶基因(RPK),该基因在禾本科植物及双子叶植物中具有很强的保守性。本研究根据大麦RPK的CDS序列开发了5个STS标记,5个标记在Pm6的作图群体、小麦近缘物种及其这些物种在中国春背景下的二体异附加系中的扩增结果表明,该基因在两个作图群体中(IGVI-465/Prins和IGVI-466/Prins)均与Pm6基因紧密连锁；RPK基因在大麦BETZES(HH)、黑麦BLANCO(RR)、Ae. speltoides(SS)、Ae. longissima(S1S1)、Ae. geniculata(MgMg)、Ae. peregrina(SpSpUpUp)及Pm6的原始亲本T. timopheevii(AAGG)中显示出高度的保守性,能够特异地追踪2H、2R、2S、2S1、2Mg、2Sp、2Up和2G染色体,因此,RPK基因可作为小麦及其近缘物种第二部分同源群染色体的标记基因。为了克隆小麦的RPK基因,本研究利用STSRPK-F1/R4引物筛选小麦品种小偃54 BAC文库,得到小麦中的RPK基因全长序列,命名为TaRPK.进一步地根据小偃54中TaRPK的序列设计引物,通过同源克隆的方法在含Pm6基因的渐渗系IGVI-465中克隆到TaRPK基因分别为1650 bp和1275 bp的gDNA和cDNA序列,命名为TaRPK1。TaRPK1的gDNA包含有4个外显子和5个内含子；编码424个氨基酸的蛋白质,结构预测发现,该蛋白包含一个信号肽和一个跨膜结构域但缺少典型的胞外结构,胞内是一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域。在IGVI-465基因组中,TaRPK1基因存在三个不同的拷贝,分别来自2A和2D染色体以及2G,其中只有来自2G的拷贝TaRPK1-2G具有转录活性,并且是一个选择性剪切的基因,有两种不同的剪切方式。TaRPK1-2G主要定位在细胞核和细胞膜中。利用Q-PCR分析TaRPK1-2G在不同胁迫诱导下的表达特征结果表明,该基因主要受MeJA的诱导上调表达。