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木材是地球上含量丰富的可再生资源,是重要的工业原材料。木材的形成主要依赖于木本植物中维管形成层的活动。维管形成层通过不断向内分裂分化,进而产生次生木质部,即木材。该发育过程受到很多遗传和其他内源因子的调控,其中转录因子发挥着极其关键的调控作用。本研究解析了毛果杨(Populus trichocarpa)形成层特异表达转录因子基因DWARF AND LOW-TILLERING(DLT)和 WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 4(WOX4)的调控功能,为揭示木本植物维管形成层的发育提供了新线索。本研究首先对PtrDLT和Ptr WOX4进行基因克隆,用于解析其在毛果杨形成层发育过程中的功能。通过基因蛋白序列比对分析发现,毛果杨基因组上存在两个DLT基因PtrDLT-A和PtrDLT-B,蛋白序列同源性高达94.1%;也存在两个WOX4基因PtrWOX4-A和PtrWOX4-B,蛋白序列同源性高达97.2%,预示这两对基因可能分别存在功能冗余。根据基因序列分析结果进行gRNA的设计,分别构建pEgP237的PtrDLT-A和PtrDLT-B基因双突变CRISPR载体以及PtrWOX4-A和PtrWOX4-B基因双突变CRISPR载体。通过农杆菌介导的快速遗传转化法对毛果杨进行遗传转化,分别获得PtrDLT-A和PtrDIT-B两个基因共同敲除突变体株系,PtrWOX4-A和Ptr WOX4-B两个基因共同敲除突变体株系。表型分析结果表明,PtrDLT基因突变后导致植株的树高低于野生型植株,地径和茎节数小于野生型植株。组织细胞学分析结果显示,相比于野生型,PtrDLT基因突变使木质部中纤维细胞排列紧密,射线细胞横截面宽。Ptr WOX4基因突变后导致植株呈现出矮小、茎干纤细、叶片狭小的特点,同时突变体植株后期停止生长,顶芽和根部发育不良,植株顶端优势破坏,底部生长出大量侧枝。组织细胞学分析结果显示,PtrWOX4基因突变显著影响形成层发育,导致木质部分化紊乱,细胞壁变薄。本研究对突变体及野生型毛果杨进行转录组(RNA-seq)分析,结果发现PtrDLT基因突变影响少数几个形成层功能相关基因,但木质部中几乎全部下调细胞壁合成酶相关基因,这表明PtrDLT基因的缺失对木质部发育产生影响。PtrWOX4基因突变导致大量形成层特异表达基因的转录发生改变,同时也影响大量形成层相关功能基因,表明PtrWOX4基因是调控维管形成层发育的关键基因。此外,研究发现PtrWOX4基因突变也影响顶端分生组织的部分干细胞相关基因的表达,表明PtrWOX4基因还参与顶端分生组织发育。综上所述,毛果杨PtrDLT基因参与调控木质部分化,但对维管形成层发育影响较小;毛果杨PtrWOX4基因是调控维管形成层发育的关键基因,同时参与调控顶端分生组织发育,这些研究结果为后续精细调控机制的深入研究奠定了基础。