【摘 要】
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多环芳烃（PAHs）是一类在土壤、水体和沉积物中常见的污染物,因为其难降解性和致癌、致畸、致突变的三致作用,目前已引起了广泛的关注。菲是含有三致相关化学结构“Bay-regin”、“K-regin”的最小的多环芳烃。因此,菲通常被作为模型底物来研究多环芳烃的降解。目前已经报道的菲的降解途径主要有水杨酸途径、邻苯二甲酸盐途径和2-羟基-1-萘甲酸途径。水杨酸途径和邻苯二甲酸盐途径在早期都会形成1-羟
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多环芳烃（PAHs）是一类在土壤、水体和沉积物中常见的污染物,因为其难降解性和致癌、致畸、致突变的三致作用,目前已引起了广泛的关注。菲是含有三致相关化学结构“Bay-regin”、“K-regin”的最小的多环芳烃。因此,菲通常被作为模型底物来研究多环芳烃的降解。目前已经报道的菲的降解途径主要有水杨酸途径、邻苯二甲酸盐途径和2-羟基-1-萘甲酸途径。水杨酸途径和邻苯二甲酸盐途径在早期都会形成1-羟基-2-萘甲酸,1-羟基-2-萘甲酸被1-羟基-2-萘甲酸双加氧酶环切割形成2-羧基苄基丙酮酸。2-羟基-1-萘甲酸被2-羟基-1-萘甲酸双加氧酶转化为反式-2,3-二氧代-5-（2’-羟基苯基）-戊-4-烯酸,随后通过水杨酸途径代谢。环裂解双加氧酶在芳香族化合物的分解中扮演着至关重要的角色。研究菲的降解过程不仅可以用来治理菲污染,而且可以帮助了解其他多环芳烃的降解机制,为治理多环芳烃和石油污染提供相应的理论依据和实际措施。本研究通过对Arthrobacter sp.PHE06菌株的全基因组信息进行分析发现,该基因组中有两个CDS序列可能编码1-羟基-2-萘甲酸双加氧酶和2-羟基-1-萘甲酸双加氧酶,通过特异性引物我们克隆到双加氧酶基因art0021和art0161,构建了可以高效表达可溶性双加氧酶的重组大肠杆菌表达系统,获得了高纯度的重组蛋白Art0021和Art0161,并完成了重组蛋白的基本酶学性质的研究。测定了重组蛋白对底物的降解能力。主要研究结果如下:对菲高效降解菌Arthrobacter sp.PHE06的全基因组信息进行分析发现,该基因组中有两个CDS序列可能编码1-羟基-2-萘甲酸双加氧酶和2-羟基-1-萘甲酸双加氧酶。利用设计的特异性引物克隆出1-羟基-2-萘甲酸和2-羟基-1-萘甲酸双加氧酶的DNA序列art0021和art0161,并将art0021和art0161连接至p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-0021和p ET-28a-0161,利用PCR及酶切验证成功后送测序验证。将构建成功的重组质粒p ET-28a-0021和p ET-28a-0161转化至BL21（DE3）细胞中,以IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导获得高表达量的蛋白Art0021和Art0161,SDS-PAGE电泳显示有Art0021和Art0161目的条带,且是可溶性重组蛋白。Ni柱亲和层析纯化后Art0021和Art0161蛋白大小均在45k Da左右。通过酶活实验发现外源表达蛋白Art0021和Art0161对底物1-羟基-2-萘甲酸（1-H2NA）和2-羟基-1-萘甲酸（2-H1NA）都有酶活。其中Art0021对于1-H2NA的Km为4.178 mmol·L-1,Kcat/Km为7.66×10~6mol-1·L·s-1;Art0161对于1-H2NA的Km为2.025 mmol·L-1,Kcat/Km为1.5×10~7mol-1·L·s-1;Art0021对于2-H1NA的Km为1.68 mmol·L-1,Kcat/Km为2.45×10~7 mol-1·L·s-1;Art0161对于2-H1NA的Km为8mmol·L-1,Kcat/Km为4.16×10~6mol-1·L·s-1。Art0021和Art0161蛋白降解底物的最适p H在7.5-8.5,最适温度在30-50℃。同时在无细胞提取物中也检测到了目的蛋白的酶活。通过实时荧光定量PCR发现,以菲为唯一碳源时,菌株中编码1-羟基-2-萘甲酸/2-羟基-1-萘甲酸双加氧酶的基因转录水平比以葡萄糖为唯一碳源时高,其中art0021为5.67倍,art0161为3.78倍。同时,在以菲为唯一碳源培养至对数期后,加入葡萄糖,目标基因的转录水平会出现明显下降。所以,推测Arthrobacter sp.PHE06中编码1-羟基-2-萘甲酸/2-羟基-1-萘甲酸双加氧酶的基因是被菲诱导表达。同时,以2-H1NA为唯一碳源培养的菌株中art0021的表达量明显高于以葡萄糖为碳源培养的菌株,推测可能art0021的表达可以被2-H1NA诱导。
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