论文部分内容阅读
研究背景Urotensin Ⅱ（UⅡ,尾加压素Ⅱ）最初来源于虾虎鱼（goby fish）的下垂体,它是近年来在哺乳动物体内发现的新的一种收缩血管物质,呈血管活性肽成分,人体内孤立的G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor 14,GPR14,UT）为其特异性受体,UⅡ及其受体在全身多个组织器官中均有表达,且主要存在于心脏及动脉血管中,提示UⅡ参与了心血管系统稳态的调节过程。许多研究显示尾加压素Ⅱ与其受体结合后,可发挥各种生物学反应,表明UⅡ可能参与了各种类型心血管疾病的发生发展进程。以往的研究发现,临床心衰患者血清UⅡ水平明显升高,在终末期心衰患者心肌组织中UⅡ呈高表达;同时在冠状动脉结扎造成心肌梗塞大鼠动物模型中发现左心室UⅡ及其特异性受体表达呈时间依赖性增高,表明UⅡ可能参与了左心室重构过程,进而在心力衰竭进程中起着一定的作用。另有研究提示,UⅡ参与了心肌梗塞后心脏的心室重构进程,可能有蛋白激酶途径机制、丝裂原活化蛋白激酶途径以及钙调神经磷酸酶等途径的参与,但UⅡ对于左心室重构方面的确切机制尚不清楚,需进一步探讨。c AMP-PKA途径是细胞信号转导的主要途径之一,PKA信号通路参与了心肌肥大的作用,我们曾在前期研究中利用Langendorff离体大鼠心脏模型,观察到UⅡ对大鼠离体心脏的心功能起抑制效应,呈剂量依赖性方式,且在腹主动脉缩窄致心力衰竭大鼠模型中,观察到与正常大鼠相比,UⅡ对心衰大鼠心脏的功能抑制效果更强,同时给予PKA特异性拮抗剂KT5720,可阻断UⅡ对正常和心衰大鼠心功能的抑制效应,由此我们得出c AMP-PKA信号通路可能参与了尾加压素Ⅱ对正常和心衰大鼠心功能的抑制效应。在众多导致心力衰竭的因素中,慢性压力超负荷为其中的重要因素之一,在此病理生理状态下,大鼠心肌组织中UⅡ是否参与了该过程所致心力衰竭时心肌纤维化的发生以及可能涉及的相关机制目前仍未明确。由此我们推测是否存在这样一种可能性,即在慢性压力超负荷导致心力衰竭过程中,c AMP-PKA途径参与了心肌纤维化的进程。由于心肌细胞内游离钙增高,可引起心肌细胞收缩,研究显示UⅡ与UT结合后对心脏发挥的多种生物学反应均需要钙离子介导,而目前UⅡ是否参与心肌细胞内Ca2+内流的过程,以及与Ca2+内流的过程相关的信号转导机制仍需进一步阐明。我们课题组前期对腹主动脉缩窄致心衰大鼠的心功能进行了研究,结果提示UⅡ对心衰大鼠心功能有抑制作用,由此我们提出设想,UⅡ对大鼠心功能的抑制效应是否可能与Ca2+内流有关。综上所述,本研究拟在慢性压力超负荷大鼠模型上,观察UⅡ/UT系统促心肌纤维化的作用及可能的靶点,并利用乳鼠心肌成纤维细胞培养方法及单个心室肌细胞膜片钳技术,进一步研究UⅡ促心肌纤维化的分子机制及与c AMP-PKA通路的关系,为今后研发干预UⅡ促心肌纤维化通路上的新型药物、寻找促进心肌纤维化发生发展的新的作用机制提供重要的依据。第一部分UⅡ/UT系统及PKA在慢性压力超负荷大鼠心肌组织中表达的变化目的:观察心力衰竭状态下,大鼠心肌组织中UⅡ/UT系统、col-Ⅰ、Ⅲ及PKA的表达。方法:建立慢性压力超负荷大鼠动物模型,采用腹主动脉缩窄法,SD大鼠45只,采用随机选取的方法,假手术组设定为15只,30只为模型组,于造模后4w、8w、12w动态观测各项指标:（1）超声心动图进行心功能检测;（2）右颈总动脉插管行血流动力学监测;（3）心肌组织病理特征,HE、Masson染色后光镜下观察;（4）免疫组化观察UⅡ、GPR14、col-Ⅰ、col-Ⅲ在心肌组织中的表达情况;（5）ELⅠSA法测定血浆中c AMP的含量;（6）运用Western Blot观察UⅡ、GPR14、col-Ⅰ、col-Ⅲ、PKA蛋白表达的变化。结果:（1）LVEDP在造模后4w、8w、12w,随时间的延长呈明显升高趋势,12w后LVEDP大于15mm Hg;（2）超声心动图检测,可见模型组大鼠造模4w后心室壁开始增厚,且随着时间延长,模型组大鼠IVSTd、LVPWTd、和LVDd均显著增加,12w后左心室扩大最严重;（3）模型组大鼠心肌组织HE、Masson染色显示,胶原纤维的表达随造模时间的延长明显加重,8w、12w中的表达尤为明显;（4）免疫组化法显示模型组UⅡ、col-Ⅰ、col-Ⅲ在心肌间质中的表达显著增加,GPR14主要表达在心肌细胞胞浆中,呈时间依赖性在胞浆中表达增加;（5）造模后,血浆中c AMP浓度逐渐增高,呈现时间依赖性（P<0.01）;（6）模型组大鼠心肌组织中UⅡ、GPR14、col-Ⅰ、col-Ⅲ、PKA蛋白表达均呈时间依赖性升高,8-12w尤为明显（P<0.01）。结论:（1）腹主动脉缩窄可建立大鼠心力衰竭模型,此模型主要是由于造成了慢性压力超负荷所致,该模型中出现明显的心肌纤维化,且随着心衰时间的延长,心肌纤维化程度逐渐加重;（2）UⅡ/UT系统可能在慢性压力超负荷所致心力衰竭心肌纤维化的过程中有着重要的作用;（3）c AMP-PKA途径可能参与了该过程中大鼠心肌纤维化的进程。第二部分心肌成纤维细胞胶原合成过程中Urotensin Ⅱ所起的效应及相关信号通路的研究目的:观察UⅡ对于成纤维细胞胶原合成中的效应并探讨c AMP-PKA通路在此过程中的作用。方法:乳鼠成纤维细胞分离并进行培养,选用第5代细胞随机分组:（1）对照组;（2）UⅡ组:UⅡ10-8mol/L;（3）UⅡ+KT-5720组:UⅡ10-8mol/L+KT5720 1μmol/L;（4）UⅡ+SB-611812组:UⅡ10-8mol/L+SB-611812 1μmol/L。ELⅠSA法测定col-Ⅰ、col-Ⅲ的浓度;Western Blot检测col-Ⅰ、col-Ⅲ蛋白表达的变化。结果:10-8mol/L UⅡ可显著刺激各组细胞中col-Ⅰ、col-Ⅲ的生成（P<0.01）,加入UⅡ受体拮抗剂（SB-611812）及PKA特异性阻断剂（KT 5720）,与UⅡ组相比,各组细胞中col-Ⅰ、col-Ⅲ的含量及表达均明显下降（P<0.05）。结论:UⅡ可诱导心肌成纤维细胞胶原合成过程,而c AMP-PKA信号通路可能也参与其中。第三部分UⅡ对大鼠心脏效应的电生理研究目的:探讨UⅡ对大鼠心脏效应的电生理机制,并进行相关信号转导通路的研究。方法:胶原酶法急性分离大鼠单个心室肌细胞,利用膜片钳技术,加用KT5720及不同浓度的UⅡ,观察心室肌细胞上L-型钙电流(Ica-L)峰值的变化。结果:用(10-910-5mol/L)UⅡ刺激单个心肌细胞,可见Ica-L峰值降低,且呈浓度依赖性,分别下降为（6.70±1.78）p A/p F、（5.93±2.02）p A/p F、（5.40±2.15）p A/p F、（4.54±2.00）p A/p F、（3.80±1.82）p A/p F,与对照组（8.03±1.20）p A/p F相比,有统计学差异（P﹤0.05）;⑵在UⅡ(EC50=10-8mol/L)的基础上给予KT5720,可以逆转UⅡ对Ica-L的抑制效应（P>0.05）;⑶在灌流KT5720的基础上给予UⅡ(EC50),观察到1μmol/L KT5720本身可抑制Ica-L,在此基础上给予10-8mol/L UⅡ,UⅡ并不能进一步抑制Ica-L（P>0.05）,提示UⅡ对Ica-L的抑制作用可被KT5720阻断。结论:UⅡ可降低心肌细胞Ica-L峰值,呈浓度依赖性表现,而KT 5720可阻断上述过程,提示UⅡ可通过抑制心肌细胞L-型钙电流,进而发挥其心功能抑制效应,而在此过程中,c AMP-PKA通路可能参与其中。