负载EGCG的多酚氧化酶-果胶纳米颗粒的制备与表征

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茶汤中含有大量在冲泡过程中形成的微纳米胶体颗粒。它们是茶叶的原生成分受热从叶肉组织间或细胞内迁移进入水相的过程中,在多种化学键的共同作用下,自组装形成微纳米尺度的聚集体,构成了茶汤胶体相的主体,影响着茶的品质与功能。本课题前期研究分离并鉴定了红茶茶汤中的自组装纳米胶粒,发现其主要成分包括果胶、多酚氧化酶及儿茶素。本研究以其为原型,从正山小种红茶茶汤中提取并鉴定茶汤果胶,通过热诱导人工构建果胶-多酚氧化酶颗粒,并以它为载体装载酯型表儿茶素EGCG,并表征其颗粒理化性质和生物活性。主要研究内容和结果如下:(1)以水提醇沉法从茶汤中提取果胶,以三氯乙酸(TCA,3%)去除蛋白质和多酚类物质,蛋白质清除率约84%,果胶损失率低于14%。以咔唑硫酸法、福林酚法分别测定了茶汤果胶中含半乳糖醛酸554.8μg/m L、多酚15.3μg/m L;用傅里叶红外光谱鉴定果胶酯化度为53%,多角度光散射法鉴定果胶分子量为54.9 k Da;以高效液相法测定果胶的单糖组分,推断茶汤果胶主要为HG型和RG?型,并可能含有少量XG型果胶,几乎不含RGⅡ型果胶。(2)以多酚氧化酶和茶汤果胶通过热诱导制备自组装纳米颗粒PPO-Pectin NPs(PP-NPs),以动态光散射技术表征颗粒的粒径、光强及ζ-电位等胶体性质,研究不同制备条件(p H、温度、PPO与果胶配比)对PP-NPs的影响。最佳制备条件为:以去离子水配置浓度为0.5 mg/m L的PPO和0.5 mg/m L的果胶溶液,PPO与果胶质量比为1:1,90℃保温30 min,可得平均水合粒径241.3 nm,ζ-电位-34.3 m V的纳米颗粒,在酸性条件下稳定,碱性条件下易分解,能耐受高温。(3)以同样方法制备PPO-果胶-酯型儿茶素(EGCG)纳米颗粒,即PPE-NPs(PPO-Pectin-EGCG NPs)。以HPLC法测定PPE-NPs的EGCG装载率为32.4%(不考虑热损失),提高了后者的热稳定性。巨噬细胞MTT实验证明,PP-NPs和PPE-NPs对细胞均无明显毒性,存活率均在90%以上。以ORAC法和细胞胞内抗氧化(CAA)法测定颗粒的抗氧化活性,结果表明样品均表现出良好的抗氧化活性,其值与颗粒中的EGCG保留量呈正相关。滤过液对样品浓度的响应最弱。体外模拟消化实验表明,EGCG能耐受短时口腔消化及胃液消化,2 h消化EGCG保留率均在80%左右,但在肠消化后EGCG急剧降低,仅余8.3%,NPs负载的EGCG的稳定性优于游离态的EGCG,肠消化保留率达19.2%,并表现出更好的抗氧化活性。因此,多酚氧化酶-果胶复合纳米颗粒的装载,有望显著提高EGCG的生物可及度、生物利用度以及体内生物效应。
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