目的:1、探讨慢性睡眠剥夺所致大鼠睡眠不足与心脏功能损伤的相关性;2、探讨四逆散有效组分拮抗慢性睡眠剥夺所致大鼠心脏功能损伤的作用及作用机制。方法:第一部分大鼠模拟跑步机式慢性睡眠剥夺模型的复制首先,对购入的BW-NSD404睡眠剥夺仪进行改造,使之与EEG/EMG信号记录装置结合,并对睡眠剥夺装置及外界环境产生的干扰信号进行检测与排除。然后,选取雄性SD大鼠16只,适应实验环境7天后,随机分成5 s休息/5 s剥夺组及空白对照组,每组8只。对两组大鼠进行EEG记录电极及EMG记录电极的埋置。动物恢复7天后,对5 s休息/5 s剥夺组大鼠同时进行连续5天的睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度)及EEG/EMG信号记录,空白对照组大鼠未进行睡眠剥夺并连续记录5天的EEG/EMG信号。最后,利用睡眠分析软件对两组大鼠连续5天的EEG/EMG信号以觉醒总时间及睡眠总时间的形式进行分析、统计,明确大鼠模拟跑步机式慢性睡眠剥夺模型的可靠性。第二部分不同强度的慢性睡眠剥夺对大鼠的觉醒-睡眠时间及睡眠时相的影响选取雄性SD大鼠24只,适应实验环境7天后,随机分成5 s休息/5 s剥夺组、10min休息/10 min剥夺组及空白对照组,每组8只。对各组大鼠进行EEG记录电极及EMG记录电极的埋置。术后动物恢复7天后,对5 s休息/5 s剥夺组及10 min休息/10min剥夺组大鼠同时进行连续9天的睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度、10 min休息/10 min剥夺强度)及EEG/EMG信号记录,空白对照组大鼠未进行睡眠剥夺并连续记录9天的EEG/EMG信号。最后,利用睡眠分析软件对各组大鼠连续9天的EEG/EMG信号以觉醒总时间、睡眠总时间,NREM期睡眠时间、REM期睡眠时间的形式进行分析、统计,研究不同强度的慢性睡眠剥夺对大鼠的觉醒-睡眠时间及睡眠时相的影响。第三部分不同强度的慢性睡眠剥夺1天、3天、5天、7天、9天对大鼠心率变异性的影响选取雄性SD大鼠120只,适应实验环境7天后,将实验动物随机分成5s休息/5s剥夺强度下持续睡眠剥夺1天组、3天组、5天组、7天组、9天组和10 min休息/10 min剥夺强度下持续睡眠剥夺1天组、3天组、5天组、7天组、9天组与未进行睡眠剥夺的1天组、3天组、5天组、7天组、9天组,共计15组,每组8只。将睡眠剥夺组大鼠分别按5 s休息/5 s剥夺强度、10 min休息/10 min剥夺强度对1天、3天、5天、7天和9天组大鼠进行相应天数的睡眠剥夺,不进行剥夺的1天、3天、5天、7天和9天组大鼠在未运行的睡眠剥夺仪中饲养相应天数。不同强度的各组大鼠在睡眠剥夺或饲养相应天数后,在麻醉状态下,利用BL-420F生物机能实验系统进行大鼠Ⅱ导联体表心电图记录并分析各组大鼠的心率变异性时域相关指标SDNN、RMSSD及频域相关指标LF、HF、LF/HF,研究不同强度的慢性睡眠剥夺1天、3天、5天、7天、9天对大鼠心率变异性的影响。第四部分慢性睡眠剥夺大鼠觉醒总时间与心率变异性变化的相关性研究选取雄性SD大鼠80只,适应实验环境7天后,随机分成5 s休息/5 s剥夺强度下持续睡眠剥夺1天组、3天组、5天组、7天组、9天组和10 min休息/10 min剥夺强度下持续睡眠剥夺1天组、3天组、5天组、7天组、9天组,共计10组,每组8只。分别对各组大鼠进行EEG信号记录电极及EMG信号记录电极的埋置。术后动物恢复7天后,对各组大鼠同时进行连续1天、3天、5天、7天、9天的睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度、10 min休息/10 min剥夺强度)及EEG/EMG信号记录。各组大鼠睡眠剥夺及EEG/EMG信号记录完成后,在麻醉状态下,利用BL-420F生物机能实验系统进行大鼠Ⅱ导联体表心电图记录。利用睡眠分析软件对各组大鼠的EEG/EMG信号以觉醒总时间的形式进行分析、统计,并利用BL-420F生物机能实验系统分析相应大鼠的心率变异性时域相关指标SDNN、rMSSD及频域相关指标LF、HF、LF/HF,经过统计学的双重相关性分析方法,研究慢性睡眠剥夺大鼠觉醒总时间与心率变异性变化的相关性。第五部分慢性睡眠剥夺所致大鼠心率变异性变化的机制研究一、慢性睡眠剥夺对大鼠脑内相关区域神经元形态及神经元中c-Fos蛋白表达的影响选取雄性SD大鼠16只,适应实验环境7天后,随机分成模型组及空白对照组,每组8只。适应结束后,对模型组大鼠进行连续5天的慢性睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度),空白对照组大鼠在未运行的睡眠剥夺仪中饲养5天。完成后,立即麻醉大鼠并灌流取脑,利用HE染色技术及免疫组织化学技术,研究慢性睡眠剥夺对大鼠脑内MnPO区域、PVN区域、VLPO区域、LH区域、LC区域及Sol区域神经元形态及神经元内c-Fos蛋白表达水平的影响。二、慢性睡眠剥夺对大鼠下丘脑内NO及NOS含量和血清中NE及EPI含量的影响选取雄性SD大鼠16只,适应实验环境7天后,随机分成模型组及空白对照组,每组8只。适应结束后,对模型组大鼠进行连续5天的慢性睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度),空白对照组大鼠在未运行的睡眠剥夺仪中饲养5天。完成后,对各组大鼠腹主动脉取血、断头取脑并剥离下丘脑,利用酶联免疫测定技术,研究慢性睡眠剥夺对大鼠下丘脑内NO、NOS含量及血清中NE、EPI含量的影响。第六部分四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠心率变异性的干预作用选取雄性SD大鼠16只,适应实验环境7天后,随机分为模型组及给药组。第8天灌胃给予给药组大鼠四逆散有效组分(450 mg/kg),灌胃给予模型组大鼠相同体积的含有2%吐温-80的生理盐水,连续给药7天。在给药第3天开始,对两组大鼠进行连续5天的慢性睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度)。睡眠剥夺完成后,在麻醉状态下,利用BL-420F生物机能实验系统进行大鼠Ⅱ导联体表心电图记录并分析各组大鼠的心率变异性时域相关指标SDNN、rMSSD及频域相关指标LF、HF、LF/HF,研究四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠心率变异性的干预作用。第七部分四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠心率变异性干预作用的机制研究一、四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠脑内相关区域神经元形态及神经元中c-Fos蛋白表达水平的影响选取雄性SD大鼠16只,适应实验环境7天后,随机分为模型组及给药组。第8天灌胃给予给药组大鼠四逆散有效组分(450 mg/kg),灌胃给予模型组大鼠相同体积的含有2%吐温-80的生理盐水,连续给药7天。在给药第3天开始,对两组大鼠进行连续5天的慢性睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度)。睡眠剥夺完成后,立即麻醉大鼠并灌流取脑,利用HE染色技术及免疫组织化学技术,研究四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠脑内相关区域神经元形态及c-Fos蛋白表达水平的影响。二、四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠下丘脑内NO及NOS含量和血清中NE及EPI含量的影响选取雄性SD大鼠16只,适应实验环境7天后,随机分为模型组及给药组。第8天灌胃给予给药组大鼠四逆散有效组分(450 mg/kg),灌胃给予模型组大鼠相同体积的含有2%吐温-80的生理盐水,连续给药7天。在给药第3天开始,对两组大鼠进行连续5天的慢性睡眠剥夺(5 s休息/5 s剥夺强度)。睡眠剥夺完成后,对两组大鼠腹主动脉取血、断头取脑并剥离下丘脑,利用酶联免疫测定技术,研究四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠下丘脑内NO及NOS含量和血清中NE及EPI含量的影响。结果:第一部分大鼠模拟跑步机式慢性睡眠剥夺模型的复制改良后的模拟跑步机式慢性睡眠剥夺装置能够与EEG/EMG信号记录装置相结合,记录的EEG/EMG信号清晰、稳定。实验结果表明,与空白组相比,5 s休息/5 s剥夺组大鼠5天觉醒总时间极显著增加,5天睡眠总时间极显著减少。第二部分不同强度的慢性睡眠剥夺对大鼠的觉醒-睡眠时间及睡眠时相的影响实验结果表明,与空白对照组相比,采用5 s休息/5 s剥夺强度剥夺大鼠的睡眠,慢性睡眠剥夺第1-9天大鼠的觉醒总时间均极显著增加,大鼠的睡眠总时间均极显著减少,大鼠的NREM期睡眠时间均极显著减少,大鼠的REM期睡眠时间均极显著减少。与空白组相比,采用10 min休息/10 min剥夺强度剥夺大鼠的睡眠,慢性睡眠剥夺第1-9天大鼠的觉醒总时间均显著增加或极显著增加,大鼠的睡眠总时间均显著减少或极显著减少,大鼠的NREM期睡眠时间均显著减少或极显著减少,大鼠REM期睡眠时间在睡眠剥夺第1天极显著减少。与10 min休息/10 min剥夺组大鼠相比,5 s休息/5 s剥夺组大鼠在慢性睡眠剥夺第1-9天的觉醒总时间均显著增加或极显著增加,大鼠的睡眠总时间均显著减少或极显著减少,大鼠的NREM期睡眠时间在慢性睡眠剥夺第1天、第2天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天及第9天均显著减少或极显著减少,大鼠的REM期睡眠时间在慢性睡眠剥夺第1-9天均显著减少或极显著减少。第三部分不同强度的慢性睡眠剥夺1天、3天、5天、7天、9天对大鼠心率变异性的影响实验结果表明,与未进行睡眠剥夺的相应天数组相比,5 s休息/5 s剥夺强度下持续睡眠剥夺3天组,5天组,7天组及9天组大鼠的SDNN值显著降低或极显著降低,持续睡眠剥夺9天组大鼠的rMSSD值极显著降低,持续睡眠剥夺5天组大鼠的HF值极显著降低,持续睡眠剥夺1天组,3天组,5天组,7天组及9天组大鼠的LF/HF值显著增加或极显著增加。与未进行睡眠剥夺的相应天数组相比,10 min休息/10 min剥夺强度下持续睡眠剥夺1天组大鼠的SDNN值显著降低,持续睡眠剥夺9天组大鼠的LF值显著增加,持续睡眠剥夺1天组大鼠的HF值极显著降低,持续睡眠剥夺9天组大鼠的LF/HF值显著增加。与10 min休息/10 min剥夺强度下睡眠剥夺相应天数组相比,睡眠剥夺5 s休息/5 s剥夺强度下睡眠剥夺7天组及9天组大鼠SDNN值显著降低,睡眠剥夺1天组及9天组大鼠rMSSD值显著降低或极显著降低,睡眠剥夺5天组及7天组大鼠HF值显著降低或极显著降低,睡眠剥夺5天组及7天组大鼠LF/HF值显著增加或极显著增加。第四部分慢性睡眠剥夺大鼠觉醒总时间与心率变异性变化的相关性研究实验结果表明,慢性睡眠剥夺大鼠的觉醒总时间与SDNN值有极显著的相关性,呈负相关趋势,且相关程度为中度相关。慢性睡眠剥夺大鼠的觉醒总时间时间与rMSSD值有极显著的相关性,呈负相关趋势,且相关程度为中度相关。慢性睡眠剥夺大鼠的觉醒总时间与LF值有极显著的相关性,呈正相关趋势,且相关程度为中度相关。慢性睡眠剥夺大鼠的觉醒总时间与HF值有极显著的相关性,呈负相关趋势,且相关程度为中度相关。慢性睡眠剥夺大鼠的觉醒总时间与LF/HF值有极显著的相关性,呈正相关趋势,且相关程度为中度相关。第五部分慢性睡眠剥夺所致大鼠心率变异性变化的机制研究一、慢性睡眠剥夺对大鼠脑内相关区域神经元形态及神经元中c-Fos蛋白表达的影响实验结果表明,与空白组相比,模型组大鼠脑内MnPO区域、PVN区域、VLPO区域、LH区域、LC区域及Sol区域的神经元均出现不同程度的浓缩、涂染或细胞色素减少等现象,但细胞完整性均良好,未出现神经元凋亡或坏死等现象。与空白组相比,模型组大鼠脑内MnPO区域、PVN区域、VLPO区域、LH区域、LC区域、Sol区域神经元内的c-Fos蛋白表达数量均显著增加或极显著增加。二、慢性睡眠剥夺对大鼠下丘脑内NO及NOS含量和血清中NE及EPI含量的影响实验结果表明,与空白组相比,模型组大鼠下丘脑内NO及NOS含量虽稍有变化,但无统计学意义;血清内NE含量极显著增加,EPI含量显著增加。第六部分四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠心率变异性的干预作用实验结果表明,与模型组相比,给药组大鼠SDNN值显著增加,LF/HF值显著降低。第七部分四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠心率变异性干预作用的机制研究一、四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠脑内相关区域神经元形态及神经元中c-Fos蛋白表达水平的影响实验结果表明,与模型组相比,给药组大鼠脑内MnPO区域、PVN区域、VLPO区域、LH区域、LC区域及Sol区域的神经元胞体较饱满,细胞色素分泌较正常,涂染现象较少。与模型组相比,给药组大鼠脑内MnPO区域、PVN区域、VLPO区域、LH区域及Sol区域的神经元中c-Fos蛋白表达数量均显著减少或极显著减少。二、四逆散有效组分对慢性睡眠剥夺大鼠下丘脑内NO及NOS含量和血清中NE及EPI含量的影响实验结果表明,与模型组相比,给药组大鼠下丘脑内的NO及NOS含量虽稍有变化,但无统计学意义。与模型组相比,给药组大鼠血清中NE含量显著降低。结论:1.不同剥夺强度、不同剥夺时间的慢性睡眠剥夺能够导致大鼠心率变异性相关指标(SDNN、rMSSD、LF、HF、LF/HF)的改变,且不同剥夺强度、不同剥夺时间对心率变异性的影响程度有所差异,反映出调控心脏的交感神经系统活动增强,使交感神经系统处于过度兴奋状态而导致心脏功能的损伤;2.慢性睡眠剥夺导致大鼠心脏功能损伤的机制可能是通过增加大鼠脑内MnPO区、PVN区、VLPO区、LH区、LC区及Sol区内神经元活性,增加血清中NE及EPI含量,从而使交感神经系统过度兴奋来引起大鼠心脏功能损伤的;3.四逆散有效组分能够拮抗慢性睡眠剥夺所致的大鼠心率变异性的改变,具体表现在SDNN值显著增加,LF/HF值显著降低;4.四逆散有效组分改善慢性睡眠剥夺所致大鼠心脏功能损伤的机制可能是通过降低大鼠脑内MnPO区、PVN区、VLPO区、LH区及Sol区内神经元活性,降低血清中NE含量,从而降低交感神经系统兴奋性来改善大鼠心脏功能的。