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研究背景与目的脓毒症是病原体感染而产生的一种复杂的全身性炎症免疫反应,伴多种器官功能障碍,严重危及生命。脓毒症发生时,机体会同时表现出促炎反应和抑炎反应两种截然不同的免疫状态,它们之间的强弱变化决定了疾病的病理进程及预后。近年来已经逐渐认识到免疫抑制是脓毒症患者死亡的主要原因,脓毒症免疫抑制(麻痹)的研究是当前的研究热点,但治疗手段仍匮乏。Toll样受体是机体最重要的模式识别受体(PRRs)之一,PPRs对病原相关分子模式(PAMPs)的识别是启动脓毒症的关键环节,通过启动不同的信号途径参与了机体的固有和适应性免疫调节。已知内毒素耐受可导致免疫抑制,是造成脓毒症晚期患者死亡的主要原因。而研究表明,IRAK-M与内毒素耐受的形成有关。白介素-1受体相关激酶M(IRAK-M)是一种丝/苏氨酸激酶,是TLRs通路中重要的负调控因子,主要表达于单核/巨噬细胞和部分上皮细胞等。已有报道,IRAK-M的表达与脓毒症、哮喘、肺炎、自身免疫性疾病以及肿瘤等的发生发展紧密相关。已知各种内源和外源的可溶性因子以及细胞表面和细胞内的信号分子能够诱导IRAK-M的表达,但具体的对IRAK-M调控方面的报道仍较少。在本研究中验证检测了脓毒症患者的外周血单核细胞中IRAK-M的表达,以及LPS对THP1细胞中IRAK-M表达的作用;通过构建人IRAK-M基因启动子报告质粒,检测其活性并分析其关键的转录调控元件;探讨脓毒症过程中主要细胞因子TNF-α、IL-10、TGF-β对IRAK-M表达的影响;分析miR-320a在脓毒症患者单核细胞中的表达,及其对IRAK-M表达的作用和机制;探讨白藜芦醇对IRAK-M表达的影响及可能的机制。本研究主要通过离体实验,初步探讨IRAK-M的表达调控机制,为进一步了解IRAK-M在脓毒症免疫麻痹中的表达机制奠定基础。实验方法1.分离脓毒症患者和正常人的外周血单核细胞,RT-PCR检测单核细胞中IRAK-M的表达;不同浓度LPS 0、100ng/ml、1μg/ml处理THP1细胞,12小时后,RT-PCR检测每个样品IRAK-M的mRNA表达水平,24h后,Western Blot检测IRAK-M蛋白表达;用100ng/ml LPS刺激THP1细胞,分别处理0、3、6、9、12、24、48小时,RT-PCR检测IRAK-M在每个时间点mRNA表达水平。2.构建了6种含有不同长度的IRAK-M基因启动子核酸序列的荧光素酶报告基因质粒,p1442、p970、p500、p300、p200、p100;双荧光素酶报告基因检测293t、a549、beas-2b细胞中irak-m启动子报告质粒的转录活性;生物信息学方法分析具有较强转录活性的启动子区域,构建突变变体p100-delete和p100-mutant,分析关键的转录元件;干扰关键转录因子后双报告基因检测启动子转录活性,rt-pcr检测其对irak-m表达的影响。3.不同浓度il-100、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml处理thp1细胞,12小时后,rt-pcr检测irak-m的mrna表达水平,24h后westernblot检测irak-m蛋白表达;用100ng/mllps刺激thp1细胞,分别处理0、6、12、24小时,rt-pcr检测irak-m的mrna表达水平;不同浓度tgf-β0、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml处理thp1细胞,12小时后rt-pcr检测irak-m的mrna表达水平;不同浓度tnf-α0、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml处理thp1细胞,6小时后rt-pcr检测irak-m的mrna表达水平,24h后westernblot检测irak-m蛋白表达。4.分离脓毒症患者和正常人外周血单核细胞,rt-pcr检测mir-320a的表达;在thp1细胞中,分别转染nc及不同浓度10nm、50nm、100nm的mir-320a类似物,rt-pcr、westernblot检测mir-320a对irak-m表达的影响;生物信息学预测mir-320a在irak-m的3’utr结合位点,构建包含两个mir-320a与irak-m3’utr序列的结合位点的报告质粒pglo-irakm-wt,将mir-320a与pglo-irakm-wt共转染至a549细胞,双报告基因检测mir-320a对irak-m3’utr活性的影响;分别构建mir-320a与irak-m3’utr序列的结合位点突变的报告质粒,636位点突变型pglo-irakm-mut1、745位点突变型pglo-irakm-mut2和633、745位点双突变型pglo-irakm-mut3;将报告质粒分别转入a549细胞,同时转染mir-320amimics或nc,检测荧光素酶活性。5.构建人irak-m外源表达质粒,分别用20μmmg132和5mme64处理thp1及外源转入flag-irak-m表达质粒的293t细胞,westernblot分别检测内外源irak-m蛋白表达的变化;外源分别转染flag-irak-m和ha-nedd4l表达质粒,westernblot检测nedd4l对irak-m蛋白表达的影响;外源转染irak-m和nedd4l表达质粒,免疫共沉淀及免疫荧光方法检测外源nedd4l与irak-m之间的相互作用;hela细胞中外源转染flag-irak-m表达质粒36h后,不同浓度白藜芦醇分别处理细胞20h后,westernblot检测nedd4l和irak-m表达;thp1细胞经白藜芦醇处理细胞,westernblot检测irak-m表达。结果1.脓毒症时人外周血单核细胞中irak-m的mrna较正常人显著上调,且在LPS处理的人单核细胞株THP1脓毒症模型中,IRAK-M的mRNA和蛋白表达也显著增加。2.成功构建人IRAK-M基因启动子序列的荧光素酶报告基因载体P1442、P970、P500、P300、P200、P100,检测并分析他们的转录活性,发现-100~+161bp区域启动子转录活性最高;突变转录因子AP-1结合位点后启动子转录活性被抑制;干扰AP-1两个亚基后,启动子转录活性也降低,且IRAK-M的表达减弱。3.炎症因子TNF-α能够显著上调IRAK-M的表达,但TNF-α对IRAK-M启动子活性没有明显作用;而不同浓度抗炎因子IL-10、TGF-β基本没有改变IRAK-M的表达。4.在脓毒症患者单核细胞中,miR320a表达较正常人组降低;离体实验表明,miR-320a能够显著抑制IRAK-M的mRNA和蛋白表达;miR-320a可抑制IRAK-M3’UTR报告质粒的活性,且将IRAK-M 3’UTR上miR-320a的结合位点突变后,IRAK-M 3’UTR报告质粒的活性恢复。5.泛素化-蛋白酶体途径抑制剂MG132能够抑制IRAK-M的降解;E3泛素连接酶Nedd4L能明显抑制IRAK-M的蛋白表达,外源Nedd4L与IRAK-M之间存在相互作用;白藜芦醇能上调Nedd4L的表达,并且白藜芦醇可显著下调IRAK-M的蛋白表达。结论分离的脓毒症患者外周血单核细胞中IRAK-M表达上调,而miR-320a表达下调;转录因子AP-1在IRAK-M的基础转录调控中有重要作用;miR-320a在转录后水平直接靶向与3’UTR结合,调控IRAK-M的表达;白藜芦醇可能通过上调Nedd4L的表达后,抑制IRAK-M的表达,具体的调控机制仍待进一步研究。