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蠕虫是一类重要的寄生虫，对全世界的公共卫生、兽医、农业和社会经济部门产生重大影响。迄今为止，用于控制寄生虫的最重要且广谱的药物是伊维菌素（IVM）。但是，在寄生虫中已经出现了对IVM的抵抗力，且保持IVM的功效正成为一个严重的问题。从经济上讲，寄生线虫Haemonchus contortus是全球小型反刍动物的重要寄生虫。许多资料报道该寄生虫对IVM产生了抗药性。解决IVM抗性的遗传基础受到越来越多的关注。关于IVM抗性涉及多基因的证据越来越多。尽管已经提出了使用较低基因组倍数数据来筛选IVM抗药性候选基因，但IVM抗药性的遗传基础仍然难以解决。在本文中，应用种群基因组学方法，来筛选和鉴定捻转血矛线虫中与IVM抗性相关的基因,为阐明线虫抗药性的分子基础及其机制提供新的途径。
为了解线虫地理株系的遗传变异情况，分析了从不同地理区域（第2章和第3章）中分离出的Haemonchus contortus。首先，对来自中国（西藏，TB；湖北，HB；内蒙古，IM；四川，SC）、英国（UK）和澳大利亚（AS）等三个全球不同地理区域的虫株进行了全基因组的2b-RAD测序，鉴定了所有虫株中的单核苷酸多态性（SNP），并分析了不同虫株之间的遗传多样性，发现SNPs之间显示出显著的分化水平（平均Fst=0.34264）。中国西藏和四川以及英国的虫株，差异更大。中国内蒙和湖北虫株显示出对澳大利亚虫株的亲和性。然后，分析了各虫株的选择性特征，并在UK和AS虫株中分别检测到44个和3个私有选择性消除（private selective sweeps）区域。最后，对这些选择性消除区域中所包含的基因（UK和AS株分别含49和5个基因）进行了功能注释，分析了这些选择特征的生物学意义。在英国和澳大利亚虫株中检测到了选择性的特征，但没有在中国虫株中检测到选择性特征，提示不同地理来源的虫株背景遗传分化程度更高。如果不考虑这种地理背景遗传变异，应用比较基因组学方法筛选IVM相关基因时可能会导致假阳性较高的结论。
因此，接下来将重点研究遗传背景非常接近的且分别对IVM敏感和有抗性的H.contortus的虫株。测试了来自中国北方的六个捻转血矛线虫的现场种群（IVM敏感和抗IVM），并将它们与来自英国和澳大利亚的捻转血矛线虫分离株进行了比较。首先从240个成虫中制备了单个DNA样本，并使用8个微卫星标记生成了基因分型数据。然后对获得的数据进行等位基因频率和群体遗传分析。总体等位基因丰富度（平均值/基因座/种群=7.375±0.844-10.125±1.109）和预期的杂合度（平均值/基因座/种群=0.646±0.040-0.735±0.025）结果表明分离株的群体遗传变异程度很高；在所有虫株中均观察到低水平的遗传分化（Fst=0.010-0.066）；AMOVA结果显示虫株内的变异水平很高（93％）；PCA分析显示所有虫株形成混合聚类，没有明显的地理亚结构出现；种群混合分析表明各虫株种群呈现广泛的基因流动与混合。提示华北现场分离株具有非常相似的遗传背景。
然后，对所有这些种群进行全基因组重测序，以便在完整放大倍数下分析其基因组（第4章）。分别对2株IVM敏感（Shan Xi-S，SXS；Australian-S，ASS）和对6株IVM耐药（Wu Meng-R，WMR；Wu Shen-R1，WSR1；Shan Xi-R，对SXR;UK-R，UKR;Wu Shen-R2.1，WSR2.1;Wu Shen-R2.2，WSR2.2）的虫株进行了重测序（覆盖率=43X至55.8X），将读取的数据映射到参考基因组上，获得了所有虫株的SNPs（Indel）信息：[SNPs(Indel):1135117(200119)in WMR;1269230(229384)in WSR;1306283(232273)in SXR;1338090(238944)in SXS;1573743(246766)in UKR;1303834(233877)in WSR2.1;1308649(234472)in WSR2.2;and1079609(187012)in ASS]。与X染色体估计值（0.010±0.008-0.015±0.012）相比，在所有常染色体上均观察到高水平的核苷酸多样性（0.030±0.008-0.041±0.011）。在SXS和SXR之间观察到最低的遗传分化（Fst=0.014），而在SXS与UKR之间显示出最高的遗传分化（Fst=0.090）。用成对的Fst全基因组扫描（5kb）数据进行比较分析，选取Fst值明显升高的离群值窗口（最高5％截止）区间，并对位于这些区间中基因进行功能注释，发现共有26个基因可以作为IVM抗性候选基因，这些基因属于如下几类：谷氨酸盐酸盐通道，氧化还原过程（cyt-p450），GPCR，ABC转运蛋白和pgp，核激素受体，配体盐通道，乙酰胆碱盐酸盐通道，囊泡介导的离子的运输和跨膜运输。最后，Tajima’s D的分析进一步证实，所有这些候选基因都位于某种选择压力的作用区域中。总之，了解了捻转血矛线虫在IVM选择压力下的遗传结构和性质，筛选获得了一些与IVM抗性相关的候选基因，因此，可以进一步对这些基因进行功能验证实验。
最终，选择了两个候选基因（HCON_00143950，细胞色素P450的成员和HCON_00155510，GPCR）进行功能验证（第5章）。将捻转血矛线虫的卵培养到L2幼虫，然后对其进行RNAi，检测在不同浓度IVM作用下幼虫摄食情况。幼虫摄食抑制试验（LFIA）显示，干扰HCON_00143950基因显著减少了幼虫的摄食。提示基因HCON_00143950可能与捻转血矛线虫的IVM抗性密切相关。
综上所述，发现捻转血矛线虫种群具有较高的遗传多样性，并具有地理背景的遗传变异。使用种群基因组学方法，成功鉴定出了捻转血矛线虫的抗IVM的候选基因。应用RNAi技术初步鉴定了线虫的Cyt-P450（HCON_00143950）可能与IVM抗性相关。这些结果进一步加深了对IVM抗性机制的理解，为IVM抗性产生涉及多基因参与的假说提供了进一步的证据。
为了解线虫地理株系的遗传变异情况，分析了从不同地理区域（第2章和第3章）中分离出的Haemonchus contortus。首先，对来自中国（西藏，TB；湖北，HB；内蒙古，IM；四川，SC）、英国（UK）和澳大利亚（AS）等三个全球不同地理区域的虫株进行了全基因组的2b-RAD测序，鉴定了所有虫株中的单核苷酸多态性（SNP），并分析了不同虫株之间的遗传多样性，发现SNPs之间显示出显著的分化水平（平均Fst=0.34264）。中国西藏和四川以及英国的虫株，差异更大。中国内蒙和湖北虫株显示出对澳大利亚虫株的亲和性。然后，分析了各虫株的选择性特征，并在UK和AS虫株中分别检测到44个和3个私有选择性消除（private selective sweeps）区域。最后，对这些选择性消除区域中所包含的基因（UK和AS株分别含49和5个基因）进行了功能注释，分析了这些选择特征的生物学意义。在英国和澳大利亚虫株中检测到了选择性的特征，但没有在中国虫株中检测到选择性特征，提示不同地理来源的虫株背景遗传分化程度更高。如果不考虑这种地理背景遗传变异，应用比较基因组学方法筛选IVM相关基因时可能会导致假阳性较高的结论。
因此，接下来将重点研究遗传背景非常接近的且分别对IVM敏感和有抗性的H.contortus的虫株。测试了来自中国北方的六个捻转血矛线虫的现场种群（IVM敏感和抗IVM），并将它们与来自英国和澳大利亚的捻转血矛线虫分离株进行了比较。首先从240个成虫中制备了单个DNA样本，并使用8个微卫星标记生成了基因分型数据。然后对获得的数据进行等位基因频率和群体遗传分析。总体等位基因丰富度（平均值/基因座/种群=7.375±0.844-10.125±1.109）和预期的杂合度（平均值/基因座/种群=0.646±0.040-0.735±0.025）结果表明分离株的群体遗传变异程度很高；在所有虫株中均观察到低水平的遗传分化（Fst=0.010-0.066）；AMOVA结果显示虫株内的变异水平很高（93％）；PCA分析显示所有虫株形成混合聚类，没有明显的地理亚结构出现；种群混合分析表明各虫株种群呈现广泛的基因流动与混合。提示华北现场分离株具有非常相似的遗传背景。
然后，对所有这些种群进行全基因组重测序，以便在完整放大倍数下分析其基因组（第4章）。分别对2株IVM敏感（Shan Xi-S，SXS；Australian-S，ASS）和对6株IVM耐药（Wu Meng-R，WMR；Wu Shen-R1，WSR1；Shan Xi-R，对SXR;UK-R，UKR;Wu Shen-R2.1，WSR2.1;Wu Shen-R2.2，WSR2.2）的虫株进行了重测序（覆盖率=43X至55.8X），将读取的数据映射到参考基因组上，获得了所有虫株的SNPs（Indel）信息：[SNPs(Indel):1135117(200119)in WMR;1269230(229384)in WSR;1306283(232273)in SXR;1338090(238944)in SXS;1573743(246766)in UKR;1303834(233877)in WSR2.1;1308649(234472)in WSR2.2;and1079609(187012)in ASS]。与X染色体估计值（0.010±0.008-0.015±0.012）相比，在所有常染色体上均观察到高水平的核苷酸多样性（0.030±0.008-0.041±0.011）。在SXS和SXR之间观察到最低的遗传分化（Fst=0.014），而在SXS与UKR之间显示出最高的遗传分化（Fst=0.090）。用成对的Fst全基因组扫描（5kb）数据进行比较分析，选取Fst值明显升高的离群值窗口（最高5％截止）区间，并对位于这些区间中基因进行功能注释，发现共有26个基因可以作为IVM抗性候选基因，这些基因属于如下几类：谷氨酸盐酸盐通道，氧化还原过程（cyt-p450），GPCR，ABC转运蛋白和pgp，核激素受体，配体盐通道，乙酰胆碱盐酸盐通道，囊泡介导的离子的运输和跨膜运输。最后，Tajima’s D的分析进一步证实，所有这些候选基因都位于某种选择压力的作用区域中。总之，了解了捻转血矛线虫在IVM选择压力下的遗传结构和性质，筛选获得了一些与IVM抗性相关的候选基因，因此，可以进一步对这些基因进行功能验证实验。
最终，选择了两个候选基因（HCON_00143950，细胞色素P450的成员和HCON_00155510，GPCR）进行功能验证（第5章）。将捻转血矛线虫的卵培养到L2幼虫，然后对其进行RNAi，检测在不同浓度IVM作用下幼虫摄食情况。幼虫摄食抑制试验（LFIA）显示，干扰HCON_00143950基因显著减少了幼虫的摄食。提示基因HCON_00143950可能与捻转血矛线虫的IVM抗性密切相关。
综上所述，发现捻转血矛线虫种群具有较高的遗传多样性，并具有地理背景的遗传变异。使用种群基因组学方法，成功鉴定出了捻转血矛线虫的抗IVM的候选基因。应用RNAi技术初步鉴定了线虫的Cyt-P450（HCON_00143950）可能与IVM抗性相关。这些结果进一步加深了对IVM抗性机制的理解，为IVM抗性产生涉及多基因参与的假说提供了进一步的证据。