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跨膜蛋白16A（Transmembrane member 16A,TMEM16A）又称Anoctamin-1（ANO1）,是一种钙激活氯离子通道（Calcium-activated chloride channels,Ca CCs）,在许多器官和组织中均有表达,参与了众多病理生理过程,为治疗高血压、囊性纤维化、哮喘、腹泻和癌症等多种疾病的新药开发提供了广阔的空间。TMEM16A/Ca CCs功能特异性调节剂被认为可以用于治疗多种类型的疾病,而选择性的药物抑制剂对于阐明不同分子碱基的Ca CCs的生理作用、确定通道结构、分析组织分布、提纯通道蛋白具有重要意义。因此研发高效、特异性的小分子TMEM16A/Ca CCs调节剂具有非常高的价值。由于选择性问题及其他需要克服的困难,鉴定以小分子或生物制剂为靶点的钙激活氯离子通道的特定调节剂迫在眉睫。本课题主要包括以下三部分:（1）苯并菲啶生物碱化合物对TMEM16A/Ca CCs的调节作用及抗肿瘤机制;（2）桑色素类化合物对TMEM16A/Ca CCs的双向调节作用及其机制研究;（3）黄酮哌酯类化合物对容积激活氯离子通道（Volume-regulated anion channels,VRACs）的药理选择性研究。第一部分苯并菲啶生物碱化合物对TMEM16A/Ca CCs的调节作用及抗肿瘤机制目的:探讨苯并菲啶生物碱化合物对TMEM16A/Ca CCs的调节作用及抗肿瘤机制。方法:利用全细胞膜片钳技术记录苯并菲啶生物碱化合物对内源性及外源性表达的TMEM16A/Ca CCs的调节作用。采用Brd U（5’-bromo-2-deoxyuridine）、小室迁移以及流式检测苯并菲啶生物碱化合物对小鼠肺腺癌细胞（LA795）的增殖、迁移以及凋亡的影响。结果:1.苯并菲啶生物碱化合物对中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells,CHO）细胞中外源性表达的TMEM16A/Ca CCs电流的影响在浓度为30μM时,6种苯并菲啶生物碱在+80m V时抑制TMEM16A/Ca CCs电流为68.8-78.7%（n=5-7）。2.苯并菲啶生物碱浓度依赖性的抑制外源性表达的TMEM16A/Ca CCs电流苯并菲啶生物碱（1、3、10、30、100μM）以浓度依赖的方式抑制TMEM16A/Ca CCs电流,其半最大抑制(IC50)值和最大效应(Emax)值分别为5.6-12.3μM和76.8-91.0%。3.苯并菲啶生物碱对外源性表达的TMEM16A/Ca CCs通道激活电压依赖性和通道失活动力学的影响苯并菲啶生物碱对通道失活和激活没有影响且对翻转电位无作用。4.苯并菲啶生物碱抑制小鼠肺腺癌LA795内源性表达的TMEM16A/Ca CCs电流在浓度为30μM时,苯并菲啶生物碱在+80m V时抑制LA795细胞内源性表达的TMEM16A/Ca CCs电流的作用为66.7-81.2%（n=5）。5.苯并菲啶生物碱抑制小鼠肺腺癌LA795细胞增殖和迁移结果显示,6种苯并菲啶生物碱以剂量依赖的方式显著抑制细胞增殖和迁移。6.苯并菲啶生物碱诱导小鼠肺腺癌LA795细胞凋亡苯并菲啶生物碱剂量依赖的诱导小鼠肺腺癌细胞凋亡。其中白屈菜红碱和二氢血根碱作用稍弱。第二部分桑色素类化合物对TMEM16A/Ca CCs的双向调节作用及其机制研究目的:探讨桑色素类化合物对TMEM16A/Ca CCs的双向调节作用及其作用机制。方法:利用全细胞膜片钳技术,在[Ca2+]i=100 n M条件下,记录桑色素类化合物对外源性表达的TMEM16A/Ca CCs的双向调节作用及其作用机制。结果:1.桑色素类化合物对外源性表达TMEM16A/Ca CCs电流的调节作用在[Ca2+]i=100 n M,Morin和Sofulcone对去激活电流的增大作用为2.1±0.2和3.3±0.2倍;DH-Morin和M1对去激活没有影响。2.Morin和Sofulcone对外源性表达TMEM16A/Ca CCs通道的量效关系建立Morin和Sofulcone（1、3、10、30、100μM）对外源性表达TMEM16A/Ca CCs通道去激活电流幅度的调节作用的量效关系,并通过Logistic方程拟合得到药物作用的最大效应(Emax)及半最大效应浓度(IC50)。IC50分别为:10.7±1.1μM、13.5±2.3μM,Emax分别为331.1±16.6%、598.1±50.9%。3.Morin对外源性表达TMEM16A/Ca CCs通道动力学影响结果表明Morin对TMEM16A/Ca CCs具有多重作用,包括对电压的依赖性和去极化时浓度依赖性增大尾电流。4.Quercetin对外源性表达TMEM16A/Ca CCs电流的调节作用Quercetin可浓度依赖性的抑制TMEM16A/Ca CCs激活电流及尾电流。第三部分黄酮哌酯类化合物对VRACs的药理选择性研究。目的:探讨黄酮哌酯类化合物对VRACs的选择性研究。方法:采用全细胞膜片钳技术观察黄酮哌酯类化合物对TMEM16A/Ca CCs和低渗激活的容积激活氯离子通道的影响。结果:1.黄酮哌酯类化合物对VRACs的抑制作用黄酮哌酯类化合物均能不同程度的抑制VRACs。Flavoxate在微摩尔级别便可完全抑制VRACs电流,其IC50为2.3±0.3μM,Emax为91.8±2.7%。2.黄酮哌酯类化合物对TMEM16A/Ca CCs的作用30μM时Flavoxate、MFCA、3-Methylflavone和DCPIB对TMEM16A电流的抑制率分别为14.4±1.3%、15.0±1.4%、24.3±1.4%和52.9±2.3%。3.黄酮哌酯类化合物对TMEM16A/Ca CCs电流的量效关系黄酮哌酯类化合物（1、3、10、30、100μM）以浓度依赖的方式抑制TMEM16A/Ca CCs电流,其半最大抑制(IC50)值和最大效应(Emax)值分别为26.5-32.8μM和24.9-51%。4.黄酮哌酯类化合物对DRG神经元AP放电的影响结果表明黄酮哌酯类化合物和千金藤都可以减少动作电位的个数和振幅。这提示我们VRACs在伤害感受中的贡献重要且关键。结论:1.苯并菲啶生物碱化合物是一种高效的TMEM16A/Ca CCs阻断剂。2.桑色素类化合物对TMEM16A/Ca CCs具有双向调节作用。3.黄酮哌酯类化合物是一种高效的选择性VRACs抑制剂