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犬新孢子虫(Neospora caninum)属于顶复门原虫,主要引起犬的神经系统机能障碍,牛的流产、死胎和新生犊牛的运动神经系统疾病,给畜牧业造成巨大损失。近年来对新孢子虫基因功能研究发现,虫体棒状体蛋白、微线体蛋白和致密颗粒蛋白等参与新孢子虫入侵、增殖等致病过程,但仍有许多新孢子虫基因功能尤其是致病相关基因的功能尚不清楚。原癌基因调控蛋白(MYRs)可调控宿主细胞原癌基因(c-Myc)表达。近来研究报道疟原虫、弓形虫、锥虫可显著提高宿主细胞原癌基因表达量。弓形虫MYR与宿主细胞原癌基因、纳虫空泡及虫体致病相关,但新孢子虫MYR基因功能尚不清楚。因此,本研究通过免疫荧光观察NcMYR1和NcMYR2蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株(△NcMYR1)和NcMYR2基因敲除虫株(△NcMYR2),对△NcMYR1和△NcMYR2虫株在入侵、增殖、虫体毒力和致病性等方面的功能进行研究,并研究重组NcMYR1蛋白和△NcMYR1虫株对小鼠抗新孢子虫野生株感染的保护作用,以期明确NcMYR1和NcMYR2的功能,为研究新孢子虫对宿主的致病性和研究新孢子虫病的防治提供理论基础。1、NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体中的亚细胞定位通过生物信息学分析获得NcMYR1和NcMYR2基因序列,原核表达技术制备和纯化重组NcMYR1和NcMYR2蛋白,制备抗NcMYR1和NcMYR2蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光对新孢子虫NcMYR1和NcMYR2蛋白进行亚细胞定位。首先,成功构建pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2基因表达载体,并成功诱导表达pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2重组蛋白,发现pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2重组蛋白均为上清表达,随后纯化蛋白并免疫小鼠。三次免疫后将小鼠眼球采血并离心收取血清作为多克隆抗体,通过细胞内和细胞外免疫荧光观察新孢子虫NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体中的亚细胞定位。结果显示,NcMYR1和NcMYR2蛋白定位于虫体速殖子细胞质。2、NcMYR1基因敲除虫株和NcMYR2基因敲除虫株的构建运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株(△NcMYR1)和NcMYR2基因敲除虫株(△NcMYR2),通过PCR、Western blot和免疫荧光对敲除虫株鉴定。首先成功合成Nc-pSAG1-Cas9:U6-SgUPRT-NcMYR1和Nc-pSAG1-Cas9:U6-SgUPRT-NcMYR2载体并扩增DHFR同源重组基因片段。随后通过电转,培养和筛选单克隆,并通过PCR、Western blot和免疫荧光鉴定是否构建成功。结果表明△NcMYR1和△NcMYR2虫株在gRNA位点成功插入DHFR同源重组基因片段,△NcMYR1和△NcMYR2虫株不再表达NcMYR1、NcMYR2蛋白,证明成功构建△NcMYR1和△NcMYR2虫株。3、NcMYR1和NcMYR2基因功能研究通过噬斑试验、入侵、增殖、逸出试验与虫体毒力试验,以探究NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果表明,与野生虫株相比,△NcMYR1虫株的噬斑面积减小(P<0.001);入侵率降低(P<0.001);增殖率降低(P<0.001);逸出率下降(P<0.05)。△NcMYR2虫株在噬斑面积、入侵、增殖和逸出方面与野生虫株相比差异不显著(P>0.05)。将△NcMYR1、△NcMYR2虫株和野生虫株分别感染BALB/c小鼠观察小鼠生存状况,检测细胞因子、虫体数量和观察病理变化。结果表明,与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcMYR1虫株的小鼠生存率达到100%,接种△NcMYR2虫株的小鼠生存率为0%,说明敲除NcMYR1的新孢子虫毒力降低,而敲除NcMYR2的新孢子虫毒力并没有受到影响。感染△NcMYR1虫株的小鼠血清中IL-6、IL-12、IFN-γ分泌下降且差异显著(P<0.01),而感染△NcMYR2虫株小鼠的血清中IL-6分泌下降且差异显著(P<0.05),IL-12和IFN-γ分泌均升高但差异不显著(P>0.05)。qPCR结果显示,感染△NcMYR1虫株小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑荷虫量降低(P<0.05);感染△NcMYR2虫株小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑荷虫量与感染野生虫株小鼠相比均差异不显著(P>0.05)。感染△NcMYR1虫株小鼠与感染野生虫株小鼠相比心、肝、脾、肺、肾和脑病理变化减轻,而感染△NcMYR2虫株小鼠上述器官病理变化与感染野生虫株小鼠相比无明显差异。说明△NcMYR1虫株对小鼠致病性减弱。以上研究表明,NcMYR1是新孢子虫入侵和毒力基因,敲除NcMYR1蛋白后虫株生长、增殖、致病性等方面明显减弱,毒力显著降低,可作为疫苗候选分子。而敲除NcMYR2基因后虫株在生长、增殖、致病性和毒力等方面都没有显著变化。4、△NcMYR1虫株对小鼠抗野生株感染的保护作用将上述试验中毒力减弱的△NcMYR1虫株作为弱毒虫苗免疫小鼠,分别在第1、10、20、30、40d后进行尾静脉采血进行细胞因子检测,以及感染新孢子虫Nc-1虫株观察小鼠生存状态。免疫△NcMYR1虫株40天时IFN-γ达到峰值,IL-12在免疫△NcMYR1虫株10d时达到峰值。5组小鼠免疫△NcMYR1虫株后第10、20、30、40d分别感染新孢子虫野生虫株,另外一组作为阴性对照组。10d组生存率达到30%,20d组生存率达到20%,30d组生存率达到10%,40d组生存率达到80%,表明利用△NcMYR1虫株免疫的小鼠对新孢子虫野生虫株感染产生免疫保护力。将上述的重组NcMYR1蛋白做为疫苗抗原免疫小鼠,随后接种新孢子虫,观察小鼠生存状态以对NcMYR1蛋白的免疫效果进行评价。结果显示,免疫NcMYR1蛋白的小鼠,IL-12与IFN-γ分泌量与对照组相比显著升高(P<0.001),且免疫NcMYR1蛋白后感染新孢子虫,小鼠生存率达到20%。综上所述,NcMYR1和NcMYR2蛋白亚细胞定位于虫体细胞质;运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株(△NcMYR1)和NcMYR2基因敲除虫株(△NcMYR2),△NcMYR1虫株在虫体生长、增殖、虫体毒力和虫体致病力等方面显著减弱。以△NcMYR1虫株作为弱毒虫苗的免疫保护效力最高达到80%。为新孢子虫抗原疫苗的研究奠定基础。