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滑膜炎症是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）这一自身免疫性关节疾病的特征性病理表现，导致成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte, FLS）的异常增殖活化，前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）、IL-1、TNF-α等炎症介质和细胞因子是引起FLS异常增殖的重要分子。PGE2通过与G蛋白（stimulatory Gprotein, Gs）偶联的受体EP（E-prostanoid）信号通路调节细胞内环磷酸腺苷（cyclicadenosine monophosphate, cAMP）水平或其它途径是滑膜细胞活化导致滑膜炎的重要病理机制之一。β-arrestin与G蛋白偶联受体激酶（G-protein-coupled receptorkinases, GRK）联合作用，通过介导受体脱敏和内吞，对大部分GPCRs信号转导通路具有重要的负调节作用。但在滑膜细胞对EP受体信号的调节特点未见报道。课题组研究发现，临床使用的天然药物白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP），其活性单体为芍药苷（paeoniflorin, Pae），可以降低胶原性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）大鼠滑膜细胞中抑制性G蛋白（inhibitory Gprotein, Gi）的表达，恢复cAMP水平和蛋白激酶A（protein kinase, PKA）活性。因此，本研究在以往工作的基础上，以大鼠和人的FLS为对象，利用PGE2、EP2受体选择性激动剂Butaprost和β-arrestin2的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）等工具，观察β-arrestin2对EP2信号通路的调节和Pae的作用，为进一步阐明滑膜炎中FLS过度增殖的分子机制及β-arrestin2的作用，深入发现Pae抑制FLS异常增殖的新机制，寻找新的药物作用靶点提供理论依据。目的：从PGE2受体EP2和β-arrestin2的表达分布变化特点，探讨PGE2诱导FLS异常增殖的分子机制以及Pae的作用；观察EP2选择性激动剂Butaprost作用下，人FLS β-arrestin2、EP2受体和cAMP水平的动态变化，利用siRNA沉默β-arrestin2的表达后观察β-arrestin2对EP2受体的调节作用和细胞增殖的影响，揭示β-arrestin2在调控EP2受体内吞和滑膜细胞异常增殖中的作用以及Pae抑制FLS异常增殖的新机制。方法：本课题以大鼠和人的成纤维样滑膜细胞为研究对象，利用EP2受体选择性激动剂Butaprost为探针，观察人FLS被活化后EP2、β-arrestin2、cAMP水平的时间变化情况，揭示滑膜细胞被活化后细胞内的分子变化规律；以β-arrestin2的siRNA为工具，明确人FLS中β-arrestin2对EP2受体的调控作用和对PGE2作用下细胞增殖的影响。并使用PGE2作为刺激因子，探讨β-arrestin2和EP2受体在FLS异常增殖时基因蛋白表达水平和分布变化特点，Gαs表达和活性以及cAMP水平的变化，同时观察Pae对上述变化的影响，以进一步阐明Pae抑制PGE2引起FLS异常增生的分子机制。组织块培养法培养大鼠和人FLS，波形蛋白免疫组化染色鉴定细胞类型， MTT法确定PGE2和Butaprost刺激FLS增殖的亚适浓度和最适时间，3H-TdR参入法和MTT法检测Pae1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol· L-1体外给药对PGE2125μg· L-1作用下FLS增殖能力的影响，放免法测定细胞内cAMP浓度，流式细胞术检测FLS膜EP2受体水平，western blot法检测FLSEP2和β-arrestin2总蛋白、胞膜蛋白的表达水平，激光共聚焦观察Butaprost刺激人FLS0、5、10、20、30、60、120min不同时间点时EP2受体细胞分布情况，免疫共沉淀法检测Gαs活性，siRNA瞬时沉默人FLS中β-arrestin2基因表达，western blot、逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）和实时荧光定量PCR（real time fluorescent quantitation PCR, QRT-PCR）法鉴定干扰效果，EP2和β-arrestin2mRNA水平采用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测。结果：1. β-arrestin2对EP2受体内吞的调控及FLS异常增殖的影响1.1EP2受体被Butaprost活化后细胞内β-arrestin2、EP2受体分布和cAMP水平的动态变化。Butaprost刺激FLS增殖的亚适浓度为1×10-7mol· L-1，作用最强在24h左右。流式细胞术检测发现FLS0min时细胞膜上EP2受体的平均荧光强度为12.5±1.28，Butaprost的刺激引起FLS平均荧光强度逐渐升高，到20min时最高，为16.3±0.77，与0min时比较有显著统计学差异（p＜0.01），随后再刺激细胞的EP2表达又开始减少，24h时平均荧光强度为10.3±0.56，较0min时降低（p＜0.05）。Western blot检测发现Butaprost的刺激引起FLS细胞膜EP2受体表达逐渐增多，到20min左右为最多，随后EP2表达又逐渐减少，2h时恢复到接近0min水平，与流式细胞术观察到的变化特点一致。激光共聚焦显微镜观察到了相同的变化特点。但β-arrestin2细胞膜表达在Butaprost刺激20min左右开始升高，与0min比较有显著差异（p＜0.05），随后一直呈上升趋势。细胞内cAMP含量在Butaprost刺激后逐渐上升，30min左右较0min时显著增高，随后逐渐减少，2h时含量低于30min时水平，至刺激24h左右，cAMP浓度较30min时显著降低（p＜0.01），并且较0min时更加减少，差异有显著性（p＜0.05）。以上结果提示，Butaprost刺激人FLS后细胞膜EP2受体水平短暂的升高，20min后开始减少，间接反映了受体在活化了20min后开始从细胞膜内吞进入细胞质。EP2受体在被配体活化后，受体在细胞膜表达短暂增多（20min左右），引起细胞内cAMP水平先短暂的上升（30min左右），对细胞有保护作用，随后EP2受体细胞膜表达逐渐减少，同时cAMP浓度也开始下降，24h时FLS细胞出现异常增殖，EP2受体的内吞具有时间依赖性。1.2β-arrestin2对Butaprost刺激下EP2受体内吞的调控及FLS异常增殖的影响用siRNA通过Lipofectamin2000进行人β-arrestin2的瞬时沉默，经荧光显微镜观察，siRNA/Lipofectamin2000复合物去除后再培养48h siRNA转染进入细胞的较多，荧光较强，因此确定再培养时间为48h。经RT-PCR、实时荧光定量PCR、western blot预实验确定了人FLS中沉默β-arrestin2基因的有效siRNA序列为Sense：5’-CCAACCUCAUUGAAUUUGATT-3’，Anti-sense:5’-UCAAAUUCAAUGAGGU UGG TT-3’，基因沉默的效率达到80%以上。沉默了β-arrestin2基因表达后，用流式细胞术检测细胞膜上EP2受体的表达发现，Butaprost刺激人FLS0min时，X轴平均荧光强度为2.18±0.26，并随着刺激时间延长逐渐升高，1h时平均荧光强度为3.54±0.77，比0min时显著升高（p＜0.05），此后仍一直升高，到24h时平均荧光强度为6.24±1.08。提示当β-arrestin2基因被沉默后，EP2受体在激动剂刺激下逐渐向细胞膜聚集，而内吞过程受阻。沉默β-arrestin2基因表达后可部分取消PGE2引起的人FLS异常增殖，提示β-arrestin2在FLS异常增殖中发挥了重要作用。2. Pae通过影响β-arrestin2对EP2受体的调控抑制PGE2诱导的FLS异常增殖2.1Pae阻止PGE2作用下EP2受体在FLS膜表达减少PGE2125μg· L-1刺激24h，诱导大鼠和人FLS异常增殖，降低大鼠FLS细胞内cAMP浓度，减少大鼠和人FLS胞膜EP2受体表达，上调EP2的总蛋白表达和人FLS中EP2的基因表达；大鼠FLS中，Pae1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol· L-1不同程度抑制细胞增殖，Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol· L-1显著恢复cAMP水平，Pae1×10-6,1×10-5mol· L-1体外给药显著升高EP2的胞膜表达，明显降低细胞总EP2的表达，人FLS中Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol· L-1对细胞增殖有明显抑制作用，Pae1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol· L-1不同程度抑制EP2mRNA合成，并显著减少细胞EP2总蛋白表达水平，Pae1×10-6,1×10-5mol· L-1显著升高细胞膜EP2的表达，提示Pae通过抑制EP2受体异常内吞，恢复细胞内cAMP水平而发挥抑制FLS异常增殖的作用。2.2Pae减少PGE2作用下FLS β-arrestin2的总表达和细胞膜表达PGE2125μg· L-1刺激24h，上调β-arrestin2在FLS中胞膜表达和基因和蛋白总表达；Pae1×10-6,1×10-5mol· L-1体外给药明显降低大鼠FLS细胞总β-arrestin2的表达，Pae1×10-7,1×10-6,1×10-5mol· L-1可不同程度抑制大鼠FLS胞膜β-arrestin2表达。Pae1×10-6,1×10-5mol· L-1对人FLS中β-arrestin2总表达和细胞膜表达均有明显的降低作用。提示Pae通过阻止β-arrestin2合成和转膜，抑制EP2受体的异常脱敏。2.3Pae可以恢复PGE2作用下FLS低下的Gαs活性人FLS中Gαs表达水平不受PGE2刺激而发生变化，且Pae各给药浓度对其表达也没有明显作用，进一步检测Gαs活性发现，PGE2显著降低Gαs活性，Pae1×10-6,1×10-5mol· L-1明显提高活性Gαs的表达。提示Pae通过恢复Gαs活性，维持了细胞内cAMP水平，发挥阻止FLS异常增殖的作用。结论：1. Butaprost在刺激人FLS早期（20min内）可以使细胞膜EP2受体水平短暂升高、细胞内cAMP水平上升（30min左右），此后细胞膜EP2受体表达逐渐减少、cAMP浓度降低，细胞异常增殖。EP2受体的内吞和细胞内cAMP水平变化的时间依赖性与Butaprost刺激后β-arrestin2细胞膜表达逐渐升高有关。2. β-arrestin2在促进激动剂刺激下EP2受体从细胞膜内吞进入细胞质以及在人FLS异常增殖中发挥关键作用。3. Pae可以有效抑制PGE2诱导的FLS异常增殖，其机制与抑制β-arrestin2的基因和蛋白表达水平，减少β-arrestin2的胞膜募集，抑制EP2受体异常脱敏，降低EP2受体总表达但升高细胞膜EP2受体表达，抑制EP2受体内吞，提高Gαs活性，恢复细胞内cAMP浓度等有关。Pae对PGE2诱导的大鼠和人FLS β-arrestin2和EP2受体介导信号的影响以及细胞增殖的抑制作用基本相似，提示利用大鼠FLS取得的实验结果可以借鉴。