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最近大量的研究表明,实体瘤的发生和进展与中心体异常有关。中心体的异常导致异常有丝分裂、非整倍体的发生和基因组不稳定。中心体异常包括中心体数量增多和中心体结构异常。中心体数量增多与中心体过度复制、胞质分裂失败或中心体过早分离有关。中心体结构异常与中心体蛋白过度表达或异常磷酸化状态有关。进一步研究表明,实体瘤组织细胞中p53基因突变或缺失是导致非整倍体的发生和基因组不稳定的主要原因之一。P53蛋白的突变和缺失导致细胞周期CDK激酶活性增高,G1期和G2期检查点失活,中心体在S期进行多次复制及在M期发生多极有丝分裂。近年来,由于异基因造血干细胞移植、干扰素及联合化疗的临床应用,慢性粒细胞白血病患者的生存期明显延长,但仍有约70%的患者在发病后5年内发生急变。急变期出现除费城染色体以外的遗传学和染色体的改变,如染色体8和19的三倍体,而在分子水平出现p53基因的突变,其机理目前尚不清楚。最近对慢性粒细胞白血病各期患者的研究发现中心体异常,包括中心体数量增多和结构异常。而且异常的程度与临床分期有关,急变期显示更为严重的中心体异常。鉴于此,本研究拟选择p53基因作为切入点,以p53基因突变的K562细胞为模型,观察外源性野生型p53基因在K562细胞表达野生型P53蛋白后对中心体数量及中心体γ-微管蛋白表达的影响和对K562细胞增殖的影响,以期探索慢性粒细胞白血病急变发生机制以及用野生型p53基因治疗白血病的可能性。实验从三方面进行研究,主要方法、结果及结论如下:1.表达外源性野生型p53基因的白血病K562细胞模型的建立分别将含有野生型p53基因、突变型p53基因和绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体(Ad5wtp53、Ad5mtp53和Ad5GFP)在293包装细胞中反复扩增,病毒滴度测定后与阳离子polybrene共感染K562细胞,确定polybrene感染剂量。MTT法确定最适重组腺病毒感染滴度和感染时间。最后应用最适腺病毒感染滴度感染K562细胞后,经RT-PCR和Western blot检测p53mRNA和P53蛋白的表达情况。结果显示:三种重组腺病毒滴度分别达到1.0×1010efu/ml、1.0×1011efu/ml、1.0×1011efu/ml;polybrene的剂量选择为4ug/ml;感染K562细胞的最适腺病毒滴度为20000MOI,感染时间为72小时;Ad5wtp53和Ad5mtp53感染K562细胞24小时后检测到p53mRNA的表达,并可持续72小时。感染72小时后P53蛋白仍有表达。2.重组腺病毒介导的野生型p53基因对K562细胞中心体数量和蛋白的影响应用间接免疫荧光染色法对中心体γ-微管蛋白和纺锤体α-微管蛋白同时进行标记,用激光共聚焦显微镜观察中心体γ-微管蛋白的表达和有丝分裂,并对中心体进行计数。与Ad5mtp53感染组和正常对照组相比,Ad5wtp53感染K562细胞72小时后,中心体γ-微管蛋白的表达降低,中心体数量减少。3.重组腺病毒介导的野生型P53基因对K562细胞增殖的影响应用流式细胞术分析K562细胞周期、DNA含量的改变。Western blot检测P21蛋白、核磷蛋白(NPM)、磷酸化(Thr199)核磷蛋白(NPM)的表达情况。结果显示:Ad5wtp53感染K562细胞48小时、72小时后细胞周期G0/G1期阻滞,DNA含量降低;同时P21蛋白的表达升高,核磷蛋白的表达无改变,磷酸化核磷蛋白(Thr199)表达下降。Ad5mtp53和Ad5GFP感染K562细胞48小时、72小时后细胞周期G0/G1期未见阻滞,DNA含量无明显改变。同时P21蛋白的表达未见增高,核磷蛋白的表达无改变,磷酸化核磷蛋白(Thr199)表达无改变。通过上述实验可以得出以下结论:重组腺病毒介导的野生型p53基因能够在白血病K562细胞中持续表达;野生型P53蛋白能够降低K562细胞中心体数量及中心体γ-微管蛋白的表达。野生型P53蛋白可能通过上调P21的表达,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制S期DNA的合成,降低核磷蛋白第199位苏氨酸残基的磷酸化来抑制中心体的过度复制。