【摘 要】
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铁（Fe）是植物生长发育所必需的微量元素,是多种酶的辅助因子,参与植物光合作用、呼吸作用、氧化还原反应等代谢活动,Fe缺乏会严重影响植物的代谢和生长。植物金属耐受蛋白家族（MTP）又被称为阳离子扩散促进剂家族（CDF）,在金属离子的吸收转运和维持植物体内金属离子的稳态方面发挥重要作用。作为MTP家族的重要组成部分,Fe/Zn-CDF亚家族的功能尚不清楚。本论文对Fe/Zn-CDF亚家族成员之一 A
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铁（Fe）是植物生长发育所必需的微量元素,是多种酶的辅助因子,参与植物光合作用、呼吸作用、氧化还原反应等代谢活动,Fe缺乏会严重影响植物的代谢和生长。植物金属耐受蛋白家族（MTP）又被称为阳离子扩散促进剂家族（CDF）,在金属离子的吸收转运和维持植物体内金属离子的稳态方面发挥重要作用。作为MTP家族的重要组成部分,Fe/Zn-CDF亚家族的功能尚不清楚。本论文对Fe/Zn-CDF亚家族成员之一 AtMTP7的功能进行研究,主要通过以下几方面:目的基因表达模式和组织化学染色、亚细胞定位、酵母功能互补、突变体及过表达植株生理表型分析,发现在缺铁条件下,AtMTP7在维持叶绿体内Fe离子稳态中发挥重要作用。主要研究结果如下:（1）AtMTP7编码457个氨基酸,具有13个外显子和12个内含子,通过TMHMM在线预测表明其具有六个跨膜结构域,利用DNAMAN对拟南芥、水稻、黄瓜的Fe/Zn-CDF家族成员进行多序列比对,发现在第2个跨膜区具有保守特征序列H×××D（×表示任意氨基酸）。（2）利用荧光定量PCR探究AtMTP7的表达模式,发现地上部分表达量显著高于地下部分,同时在不同浓度的Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+处理条件下分析AtMTP7的转录水平,发现AtMTP7的表达不受以上金属离子缺乏或毒害的影响。进一步构建ProAtMTP7:GUS载体获得转基因拟南芥,进行组织化学染色,结果表明AtMTP7在根、叶、花及果英中均有表达,且莲座叶中的表达水平高于茎生叶,但在茎、根尖、叶柄、花梗中不表达。（3）对AtMTP7基因进行克隆,将GFP连接到AtMTP7的C末端,构建pXZP008-AtMTP7-GFP亚细胞定位载体,用PEG或者农杆菌介导的方法分别转化到拟南芥、水稻叶肉细胞原生质体和烟草叶肉细胞中,发现AtMTP7定位在叶绿体。（4）构建酵母表达载体pYES2-AtMTP7,利用醋酸锂转化方法将重组质粒pYES2-AtMTP7和空载pYES2分别转化进不同营养缺陷型酵母突变菌株中,同时以空载pYES2转入野生型酵母BY4741作为阴性对照,发现铁过量条件下,AtMTP7的表达导致铁敏感型酵母突变株Δccc1（ccc1是定位在液泡膜上的铁转运蛋白,将细胞质中过量的Fe转运至液泡内以解毒）对铁毒害更敏感,表明AtMTP7具有转运Fe2+的活性,而不具有转运其他金属离子Mn2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Co2+的活性。（5）利用T-DNA插入突变体mtp7-1和mtp7-2及CaMV35S:AtMTP7转基因拟南芥研究AtMTP7的生理功能,在铁缺乏或正常条件下水培观察表型差异并利用ICP-OES测定不同组织中金属离子含量。结果发现在缺铁条件下,突变体mtp7植株地上部分长势较野生型差,且叶片黄化现象更严重,根及地上部分干重降低。进一步测定不同组织中离子含量,发现突变体植株较野生型植株根和地上部分Fe含量无显著差异,但正常生长条件下突变体植株叶绿体中Fe离子含量较野生型植株叶绿体中Fe含量显著降低。在缺铁条件下,AtMTP7过表达植株与野生型植株相比长势更好,但过表达植株各组织中的Fe含量相对于野生型并无明显变化。以上结果表明AtMTP7是定位在叶绿体上的Fe转运蛋白,AtMTP7突变后植株长势较差,叶绿体内Fe2+含量降低,表明AtMTP7参与叶绿体内铁的吸收,有助于维持细胞内离子平衡。
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