【摘 要】
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研究背景IL-15作为一种多效细胞因子,不仅调节先天性免疫反应,而且调节适应性免疫反应,刺激记忆CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞的活化和增殖,并调控着不同非免疫细胞和组织的稳态和生长。IL-15受体（IL-15R）由三种亚基组成,即特异性高亲和力受体IL-15Rα,以及与IL-2共用的中间亲和力受体IL-2Rβ、γ。IL-15Rα广泛表达于各种免疫和非免疫细胞类型,IL-2Rβ、γ主要表达于T
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研究背景IL-15作为一种多效细胞因子,不仅调节先天性免疫反应,而且调节适应性免疫反应,刺激记忆CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞的活化和增殖,并调控着不同非免疫细胞和组织的稳态和生长。IL-15受体（IL-15R）由三种亚基组成,即特异性高亲和力受体IL-15Rα,以及与IL-2共用的中间亲和力受体IL-2Rβ、γ。IL-15Rα广泛表达于各种免疫和非免疫细胞类型,IL-2Rβ、γ主要表达于T、NK细胞表面。因此,IL-15受体除了以三聚体的形式存在于细胞膜外,大多数是以IL-15Rα单体和IL-2Rβ/γ二聚体的形式分布于细胞膜表面。胃癌在中国,尤其在甘肃地区是高发的恶性肿瘤。据2017年全球疾病负担报告显示,中国人口标准化胃癌死亡率为25.16/10万,远高于世界标准,位居全球第二。本课题组前期研究发现EBV阳性胃癌细胞由于低表达IL-15Rα,其增殖和预后明显优于EBV阴性胃癌,提示IL-15Rα在胃癌发生发展过程中发挥着重要作用。本实验进一步深入研究发现,胃癌细胞表面也表达IL-15R的另外两个亚基IL-2Rβ、γ,存在着竞争性抑制NK、T细胞表面IL-2Rβ/γ二聚体与IL-15/IL-15Rα复合物结合的风险,并提示目前临床利用IL15/IL-15Rα作用机制开发的IL-15超级激动剂可能无法有效治疗IL-2Rβ/γ高表达胃癌患者。因此,研究胃癌细胞表面IL-15R表达模式、其表达水平对肿瘤和微环境中免疫细胞的影响及机制,将对胃癌的免疫治疗以及发病机制探讨有着重大的意义。研究目的本研究首先探究IL-15Rα基因敲低后对胃癌细胞表型的影响,并在加入外源性IL-15重组蛋白后,探究IL-15/IL-15Rα信号轴对胃癌细胞表型差异的影响。其次在IL-15Rα基因敲低的基础上,继续敲低IL-2Rβ/γ基因,研究肿瘤细胞的生长和浸润免疫细胞的激活是否受IL-15R在肿瘤细胞上表达的调控。此外,我们将胃癌细胞移植到裸鼠体内,观察IL-15R的表达对体内胃癌细胞增殖的影响。最后,我们尝试探索IL-15R在胃癌细胞表面表达竞争配体和通过多种信号通路干扰免疫细胞激活的机制。研究方法1.WB/免疫组化检测胃癌细胞系和临床胃癌组织样本中IL-15Rα、IL-2Rβ、γ三种受体的表达水平。2.CRISPR-Cas9基因敲除技术对AGS、MKN-45胃癌细胞IL-15Rα基因进行敲低,基因测序和间接免疫荧光染色验证敲低效率后,通过单克隆细胞培养（有限稀释法）筛选稳定株。3.CCK8增殖试验、划痕试验、Transwell迁移实验检测IL-15Rα基因表达对胃癌细胞增殖和迁移的影响。4.CRISPR-Cas9基因敲除技术进一步对AGS胃癌细胞IL-2Rβ、γ基因进行敲低,WB/间接免疫荧光染色验证敲低效率。5.CCK8增殖实验、Transwell迁移实验检测胃癌细胞IL-15R不同的表达模式对胃癌细胞增殖、迁移等行为学影响。6.CCK8增殖实验检测外源性IL-15作用后对胃癌细胞增殖的影响,流式细胞术检测外源性IL-15重组蛋白对胃癌细胞凋亡及外周血单个核细胞（PBMCs）活化的影响。7.裸鼠实验,将胃癌细胞MKN-45（对照组、空载体组、IL-15Rα敲低组）皮下胁部脂肪垫成瘤,建立异种移植瘤模型,通过测量移植瘤大小检测胃癌细胞IL-15Rα基因敲低后在体内的细胞增殖差异。研究结果1.胃癌细胞/组织以不同水平表达IL-15Rα、IL-2Rβ、γ,且三者表达呈正相关（P＜0.05）。2.胃癌细胞表面IL-15Rα基因敲低后,胃癌细胞的增殖、迁移能力比IL-15Rα基因高表达胃癌细胞明显降低（P＜0.01）。3.胃癌细胞表面IL-15Rα、IL-2Rβ、γ基因全部敲低后,胃癌细胞的增殖能力与IL-15Rα基因单独敲低细胞相比更加降低（P＜0.01）。4.当胃癌细胞表达IL-15R但微环境中缺乏免疫细胞浸润时,加入外源IL-15可刺激胃癌细胞增殖;但IL-15R敲低后,胃癌细胞与PBMCs共培养（使胃癌细胞伴有较好的免疫细胞浸润时）加入外源性IL-15能活化PBMCs,且使胃癌细胞凋亡增加（P＜0.05）。5.裸鼠皮下移植瘤在体内生长趋势与体外实验一致（P＜0.05）。研究结论1.胃癌细胞系和癌组织表达IL-15Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ,且其表达水平相互具有相关性。2.胃癌细胞源性IL-15R可利用IL-15/IL-15R轴促进肿瘤细胞增殖,却抑制共培养免疫细胞活化;IL-15R敲低后这些现象被逆转。3.IL-15Rα高表达胃癌细胞较其敲低细胞更易在裸鼠体内成瘤,移植瘤生长速度更快,且对病灶局部注射IL-15治疗不敏感。
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