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洋葱(Allium cepa L.)是全球主要的商业化蔬菜作物,至少有139个国家种植。洋葱基因组巨大,分子生物学基础领域研究相对薄弱,特别是关于洋葱功能性基因的研究甚少。S期激酶蛋白SKP1(S-phase kinase-associated-protein 1)是普遍存在于真核生物中的一类小分子量蛋白质,其主要生物学功能在于参与了SCF复合体的形成,通过26S蛋白酶途径调控生物体内泛素介导的蛋白质降解,参与了包括植物花粉发育在内的多个生物过程。本研究主要以洋葱恢复系(DH17)和不育系(230)为材料,利用染色体步移、RACE试验、序列比对分析、农杆菌介导的遗传转化等分子生物学方法,初步阐明了洋葱AcSKP1基因在洋葱可育系和不育系中存在可变剪接现象,并且初步进行了AcSKP1基因启动子的功能验证。在此基础上开发了一个稳定高效的洋葱Ms位点的SSR分子标记(WH-SSR-1),已成功的应用于育种实践。本研究结果如下:(1)克隆了洋葱AcSKP1基因的全长序列,恢复系材料(DH17)含有5659 bp,不育系材料(230)含有5636 bp,比对分析发现,恢复系和不育系材料之间存在大量的变异位点,主要为InDel和SNP位点。这些变异位点为开发分子标记提供了信息资源。(2)初步研究证实恢复系材料(DH17)和不育系材料(230)均存在可变剪接现象。随后,我们获得了各自一个全长转录本,分别命名为AcSKP1F1和Acskp1S1。AcSKP1F1基因全长4761 bp,含有10个外显子长度为1396 bp,9个内含子,编码序列1056 bp;Acskp1S1基因全长4746 bp,含有11个外显子长度为1434 bp,10个内含子,编码序列为1410 bp。AcSKP1F1和Acskp1S1的gDNA比对结果显示了95.41%相似性,氨基酸序列相似性为92.02%。这为后续功能研究提供了序列基础。(3)克隆了恢复系(DH17)和不育系(230)AcSKP1基因的启动子序列,分别命名为AcSKP1Fp和Acskp1Sp,并且发现AcSKP1Fp和Acskp1Sp序列均包含核心启动子元件TATA-box和CAAT-box等,两者还发现了大量的光诱导元件ATCA-motif、CAAT-box、AE-box、Box 4、GT 1、I-box等;主要差异存在于激素诱导元件,AcSKP1Fp包含有2个MeJA元件、1个Auxin诱导元件和1个GA诱导元件,而在Acskp1Sp没有发现这些元件。这进一步暗示了AcSKP1基因在恢复系和不育系功能上的差异。(4)成功构建了基于pBI121、pGF和V1001双元载体的AcSKP1Fp/Acskp1Sp::GUS和AcSKP1Fp/Acskp1Sp::GFP嵌合基因启动子功能验证载体,获得了基于农杆菌GV3101工程菌,转化拟南芥,初步结果表明:Acskp1Sp被GUS染液染成蓝色而AcSKP1Fp并没有被染成蓝色。(5)利用AcSKP1原始位点开发了一个能够区分洋葱Ms位点的高效稳定的SSR分子标记,命名为WH-SSR-1。WH-SSR-1标记在纯合显性的材料中均只有1条约102 bp带的扩增,而纯合隐性材料均只有1条99 bp带的扩增,杂合材料存在2条带的扩增。该结果不仅在两个BC1分离群体中得到验证,还在32份育种材料中得到了进一步的验证。随后,我们利用该标记从OP群体中直接选育保持株和不育株,进而直接构建不育系和保持系。