【摘 要】
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该实验就人MT在大肠杆菌中的高效表达及其影响因素进行了探讨.该实验表达的hMT-Ⅱ基因是经过大肠杆菌偏爱密码子改造的MT基因,其表达量较天然cDNA有15-20倍的提高.利用pBV220
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该实验就人MT在大肠杆菌中的高效表达及其影响因素进行了探讨.该实验表达的hMT-Ⅱ基因是经过大肠杆菌偏爱密码子改造的MT基因,其表达量较天然cDNA有15-20倍的提高.利用pBV220载体表达非融合态的hMT-Ⅱ基因,表达量较高,为13.5mg/L菌液.但由于MT蛋白含有大量的半胱氧酸,其巯基之间会形成二硫键,使其形成聚合体,失去活性.因此,在纯化非融合态MT蛋白过程中,MT活性损失严重,回收率仅为1﹪.而利用亲和层来纯化的融合 态hMT-Ⅱ的表达就弥补了这一不足.该实验选用了融合态表达载体pTYB1,它将待表达的蛋 白与几丁质结合蛋白(CBD)融合,通过亲和层析可一步纯化得到,融合蛋白,并利用其特有 的自剪切机制完成目标蛋白与CBD的分离.从而大大简化了纯化步骤,有效地解决了MT蛋白 在纯化过程中容易失活问题.用pTYB1表达MT的表达量约为3mg/L菌液,而回收率可达18﹪.另外,该实验对缺失了α结构域两个半胱氨酸残基的MT进行了研究,镉结合实验表明,α结构域的半胱氨酸残基的保守对MT的生物学活性很重要.
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