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研究背景宫颈癌（cervical cancer）是一种发生在子宫颈上皮的恶性肿瘤,也是全球中仅次于乳腺癌的严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤。在我国其发病率占女性恶性肿瘤的首位,据世界卫生组织估计,我国每年新发病例13.1万,约占世界宫颈癌新发病例的28.8%。各个年龄段的女性都有可能患上子宫颈癌,然而,发病率及死亡率最高的人群集中在相对年轻的45岁至50岁的女性当中。近年来年青宫颈癌患者有明显上升趋势,保留生育功能及提高生活质量势在必行。宫颈癌好发于社会经济地位低下的妇女,可能和性卫生、HPV感染、早婚、吸烟等有关。发展中国家宫颈癌的发生率是发达国家的6倍,而且由于宫颈癌的早期筛查尚未普及,80%的患者在确诊时已经发展为浸润癌。目前对于宫颈癌早期主要采用手术治疗或放射治疗,对于中晚期以及复发、转移的宫颈癌患者多采用放射治疗结合全身化疗的治疗手段。临床发现,不同患者之间,其放化疗敏感性存在差异,导致治疗效果亦有很大不同。提高放化疗的剂量虽然在一定程度上可以提高疗效,但是不同患者的耐受性不同,并且毒副作用明显增加,严重降低患者生活质量。Bcl-2是细胞凋亡相关蛋白Bcl-2家族中的重要抗凋亡蛋白,在宫颈癌等多种肿瘤高表达,这种高表达状态与肿瘤的发生、发展、复发以及对放化疗产生的抵抗性密切相关。在凋亡的早期阶段,位于线粒体外膜上的Bcl-2发生构象改变,导致PTP通道的开放,进而使线粒体膜通透性增大,释放出如细胞色素C、凋亡蛋白激活因子-1（Apaf-1）以及凋亡诱导因子（AIF）等各种活性蛋白促进凋亡。细胞色素C与Apaf-l、Caspases-9组成凋亡启动复合体使Caspases-9被激活,进一步激活Caspase-3,最终导致细胞凋亡。棉酚（gossypol）是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物,有两种旋光异构体分别为左旋棉酚[（-）-gossypol]、右旋棉酚[（+）-gossypol],目前棉酚制剂主要有3种:醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚。棉酚最初是作为一种男性避孕药应用于临床,近年来研究发现棉酚具有显著的抗肿瘤能力,能够对多种肿瘤细胞系如前列腺癌、淋巴瘤和结肠癌等产生抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的作用。研究显示,棉酚可通过多种方式和分子靶向对肿瘤细胞进行抑制增殖和（或）诱导凋亡,包括通过直接损伤线粒体抑制细胞能量代谢,调低细胞周期调节蛋白Rb和cyclinDl蛋白的表达,抑制蛋白激酶C活性等。大量资料表明由棉酚作用于线粒体引起的凋亡是其多种诱导细胞凋亡途径中一条最为重要的细胞死亡途径。线粒体依赖性细胞凋亡通路是指Bcl-2的表达下调,引起细胞色素C从线粒体内膜释放,通过与Caspase-9结合,启动Caspase-3、Caspase-7的活化,从而调控细胞凋亡。进一步的研究证实棉酚是抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的一种小分子抑制剂,能够特异性结合在Bcl-2/Bcl-XL的BH3位点（Bcl-2 homologydomin3）,阻止其与促凋亡蛋白Bax等形成异二聚体,抑制Bcl-2/Bcl-XL的抗凋亡功能,发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究目的既往国内外关于棉酚在宫颈癌中的作用尚未见报道,本实验拟利用高表达Bcl-2蛋白的宫颈癌细胞株Hela为研究对象,研究醋酸棉酚的增殖抑制作用和凋亡诱导作用,并初步探讨其可能的作用机制,同时研究比较醋酸棉酚联合X射线对人宫颈癌细胞系的体外杀伤作用,为棉酚的进一步研究及临床应用提供实验依据,奠定理论基础。实验方法1.采用MTT比色法研究醋酸棉酚对宫颈癌细胞系Hela的体外增殖抑制作用,同时研究比较醋酸棉酚联合X射线对人宫颈癌细胞系的体外杀伤作用。2.利用Hoechst33342/PI染色法观察醋酸棉酚作用后Hela细胞核形态的变化。3.流式细胞仪分析醋酸棉酚作用后Hela细胞的细胞凋亡率。4.流式细胞仪分析醋酸棉酚对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。5.比色法研究醋酸棉酚对Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活性的影响。实验结果1.醋酸棉酚对Hela细胞具有生长增殖抑制作用,并且这种作用呈时间、剂量依赖效应。10μmol/L以上的醋酸棉酚作用24h即可显著抑制Hela细胞生长,1μmol/L的醋酸棉酚则对细胞生长没有明显影响。2.单纯放疗组与醋酸棉酚联合射线治疗组不同射线剂量Hela细胞生长抑制率分别为（7.97±1.43、15.83±1.16、27.96±1.25）%、（42.71±2.25、61.36±2.33、77.45±3.05）%。结果显示,醋酸棉酚联合射线治疗组对Hela细胞生长抑制率显著高于单纯放疗组。3.Hoechst33342/PI染色荧光显微镜下可见经20μmol/L醋酸棉酚作用24h后呈致密浓染发出强蓝色荧光的凋亡细胞核,而对照组则呈现弥散均匀,淡蓝色的正常细胞核。4.流式细胞仪可检测到在凋亡细胞细胞周期G0/G1期前出现DNA亚二倍体峰,即细胞凋亡峰。本实验中,20μmol/L的醋酸棉酚作用24h后,DNA直方图上出现了亚二倍体峰,醋酸棉酚凋亡率与对照组比较,差异显著有统计学意义（t=-19.840,P=0.000）。5.20μmol/L醋酸棉酚作用24h后,Bcl-2蛋白表达水平由对照组的（78.17±3.23）%下降至（68.97±1.94）%,差异显著有统计学意义（t=4.239,P=0.013）;Bax蛋白表达水平由对照组的（8.16±0.67）%上升至（18.88±1.36）%,差异显著有统计学意义（t=-12.254,P=0.000）;Bcl-2/Bax比值与对照组比较,差异显著有统计学意义（t=17.734,P=0.000）。6.20μmol/L醋酸棉酚作用后先后出现Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9蛋白酶的活性变化。12h、24h、48h时间点Hela细胞Caspase-3（2.32±0.15、5.44±0.20、4.34±0.04）,Caspase-8（3.70±0.15、5.45±0.20、2.36±0.16）,Caspase-9（4.36±0.33、6.40±0.19、2.84±0.08）的活化程度逐渐增高,至24h达到高峰,随后活性逐渐下降。主要结论本研究证实醋酸棉酚对宫颈癌细胞株Hela具有增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能与Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,以及Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9蛋白酶的激活有关。醋酸棉酚诱导Hela细胞凋亡是由线粒体途径及死亡受体途径共同完成的。醋酸棉酚联合X射线能够增强X射线对宫颈癌细胞株Hela的增殖抑制作用,两者之间具有协同作用。