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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性系统性自身免疫性疾病,其病理特征主要表现为滑膜炎症和关节侵蚀。目前RA发病机制仍不清楚,研究表明B细胞在RA的发病机制中发挥重要作用。B细胞活化因子(B cell activating factor of TNF family,BAFF)是维持体内B细胞稳态重要细胞因子,能够促进B细胞存活、分化和活化。BAFF有三个受体:B细胞活化因子受体(B cell activating factor of the TNF family receptor,BAFF-R)、B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)和跨膜蛋白活化因子钙离子信号调节亲环素配体(transmembrane activator and calciummodulator and cyclophilin ligand interactor,TACI)。BAFF过表达与RA等自身免疫性疾病发病机制和疾病进程密切相关。BAFF通过结合其受体激活介导的NF-κB信号通路发挥生物学效应。那么在RA病程中,BAFF是否通过其受体介导的NF-κB信号通路参与B细胞活化?目前少有报道。CP-25是芍药苷结构修饰单体化合物。课题组前期研究表明CP-25对大鼠佐剂性关节炎有明显治疗作用。CP-25还通过下调CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-Ⅱ的表达来抑制由前列腺素E2或肿瘤坏死因子α刺激的树突状细胞的成熟。那么,CP-25对实验性关节炎治疗作用是否与其调节异常活化的B细胞功能有关?CP-25对异常活化B细胞功能的调节是否与其调控BAFF/BAFF受体介导的NF-κB信号通路有关?CP-25与目前临床使用治疗RA的生物制剂依那西普(Etanercept)或利妥昔单抗(Rituximab)对B细胞功能的调节有怎样的异同点?这些都是本课题要解决的重要问题。本研究中,我们观察了RA患者血清中BAFF水平、B细胞上BAFF受体及经典和非经典NF-κB信号通路的活化情况,并分析了BAFF水平与临床和实验室指标之间的相关性。体外建立了BAFF刺激的活化B细胞模型,我们检测了经BAFF刺激的B细胞上BAFF受体及BAFF介导的NF-κB信号通路的变化。同时我们观察了CP-25对BAFF刺激的B细胞功能及BAFF介导的NF-κB信号通路的影响。并比较了CP-25和目前临床使用治疗RA的生物制剂(Etanercept或Rituximab)对B细胞功能调节的作用特点。目的:(1)阐明在RA病程中,BAFF介导的NF-κB信号通路参与B细胞活化的机制。(2)明确CP-25对BAFF与其受体介导的NF-κB信号通路的调控作用。(3)比较CP-25和生物制剂(Etanercept或Rituximab)对异常活化的B细胞功能调控的作用特点。方法:入选RA患者,在入组时评价临床和实验室指标。收集RA患者和健康对照(healthy controls,HCs)的血液样品。人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),免疫磁珠阳性分选B细胞。线性回归分析BAFF水平与临床变量或实验室参数之间的相关性;ELISA法检测血清中BAFF水平;蛋白芯片技术检测免疫球蛋白水平和细胞因子水平。体外,人淋巴细胞分离液分离正常健康人PBMCs。用BAFF(100ng/ml)和CP-25(10-5mol/L)或Etanercept(10μg/ml)或Rituximab(5μg/ml)处理后,CCK-8检测B细胞的增殖;流式细胞术分析B细胞亚群和BAFF受体(BAFFR、BCMA和TACI)的表达;Western blotting分析信号通路中蛋白MKK3、MKK6、P-p38、P-p65、TRAF2和p100/52的表达。结果:1.BAFF与其受体介导的NF-κB信号通路参与RA中B细胞活化1.1.RA血清中免疫球蛋白和细胞因子的水平高于正常人与HCs组相比,RA患者血清中Ig A、Ig E、Ig D、Ig G1、Ig G2、Ig G4水平升高;IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-4和IL-13水平明显升高。尤其是,IL-1α、IL-4和TNF-α的水平升高更明显。Ig M和IL-10水平无差异显著性。1.2.RA患者中B细胞亚群异常活化与HCs组相比,RA患者中CD19+B细胞、CD19+CD27+B细胞、CD19+CD20+CD27+B细胞和CD19+CD20-CD27+B细胞的百分比显著增加。1.3.RA患者中B细胞上BAFF三个受体表达高于正常人与HCs相比,RA患者中CD19+BAFFR+B细胞、CD19+BCMA+B细胞和CD19+TACI+B细胞的百分比显著增加。1.4.BAFF水平与RA患者中的实验室和临床指标的相关性RA患者中的BAFF水平明显高于HCs组。RA患者和HCs中BAFF的浓度分别为270±24 pg/ml和192±9 pg/ml。两组之间有显着性差异(p=0.008)。BAFF水平与RF(p=0.03)和CRP(p=0.003)的实验室参数之间存在显著相关性。BAFF水平与DAS28、SJC或TJC之间也有相关性。但BAFF水平与抗CCP抗体无关。1.5.RA患者B细胞中BAFF介导的信号通路中信号分子的表达情况与HCs组相比,RA患者中MKK3、MKK6、P-p38、P-p65、TRAF2和p52表达增高,RA中p100表达下降。2.CP-25下调BAFF与其受体介导NF-κB信号通路调控B细胞功能2.1.CP-25抑制B细胞增殖与Control组相比,BAFF促进B细胞增殖。与BAFF组相比,CP-25、Rituximab和Etanercept均能抑制B细胞增殖,三个药物之间没有差异显著性。2.2.CP-25下调活化B细胞亚群与Control组相比,BAFF能增加CD19+B细胞、CD19+CD20+B细胞、CD19+CD27+B胞和CD19+CD20+CD27+B细胞的百分比和数目。与BAFF组相比,CP-25能下调CD19+B细胞、CD19+CD20+B细胞、CD19+CD27+B细胞和CD19+CD20+CD27+B细胞的百分比和数目,与Control组比较无统计学差异。与CP-25组相比,Rituximab和Etanercept过度抑制CD19+B细胞、CD19+CD20+B细胞、CD19+CD27+B细胞和CD19+CD20+CD27+B细胞百分比和数目,明显低于Control组和CP-25组,比较有统计学差异。2.3.CP-25下调CD19+BAFFR+B细胞、CD19+BCMA+B细胞和CD19+TACI+B细胞百分含量与Control组相比,BAFF显著上调CD19+BAFFR+B细胞、CD19+BCMA+B细胞和CD19+TACI+B细胞百分含量。与BAFF组相比,CP-25下调CD19+BAFFR+B细胞、CD19+BCMA+B细胞和CD19+TACI+B细胞百分含量,与Control组比较无统计学差异。Rituximab和Etanercept过度抑制CD19+BAFFR+B细胞和CD19+BCMA+B细胞百分含量,并使CD19+BAFFR+B细胞百分含量明显低于Control组和CP-25组,比较有统计学差异。2.4.CP-25对B细胞中MKK3、TRAF2、P-p38、P-p65和p100/52表达的影响与Control组相比,BAFF能够上调MKK3、TRAF2、P-p38、P-p65和p52的表达。与BAFF组相比,CP-25、Rituximab可显著下调BAFF刺激的B细胞中升高的MKK3、P-p38、P-p65、TRAF2和p52的表达。Etanercept也可显著降低BAFF诱导的MKK3、P-p38、P-p65和p52的表达。结论:1.高水平的BAFF通过其受体介导的NF-κB信号通路参与RAB细胞的异常活化。2.RA血清中升高的BAFF水平与RA的疾病活动度相关。3.BAFF可能作为诊断和治疗RA的一种新的生物标志物。4.CP-25对B细胞功能的适度下调可能与其调节NF-κB信号通路有关。5.Etanercept和Rituximab过度抑制BAFF刺激的B细胞功能,其对B细胞功能的影响明显强于CP-25。提示了这可能是其临床治疗产生不良反应的机制之一。6.CP-25可能是有前景的抗炎免疫软调节药物。