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目的:临床发现慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者血管钙化发生率是普通人群的10~30倍。有研究发现酸性环境能够抑制肾衰竭大鼠血管及软组织钙化,但其中的机制目前尚不清楚。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)最初是在T细胞中因其免疫调节功能被发现的,之后的研究表明NFAT在成骨细胞分化和某些刺激诱导的血管钙化中也发挥重要作用。本实验拟观察NFATc1在酸抑制血管钙化过程中发挥的作用及其可能机制。方法:1动物实验1.1动物模型制备将24只清洁级5周龄雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组、慢性肾衰竭组、血管钙化组、酸干预钙化组。其中假手术组大鼠进行肾周筋膜分离,使用1.5%甲基纤维素进行每日灌胃;慢性肾衰竭组进行5/6肾切除术,使用1.5%甲基纤维素进行每日灌胃;血管钙化组进行5/6肾切除术,使用1.5%甲基纤维素+骨化三醇(600 ng-1·kg-1·24 h-1)进行每日灌胃;灌胃,酸干预组大鼠行5/6肾切除术,使用1.5%甲基纤维素+骨化三醇(同上)+0.28mmol/L氯化铵每日饲喂。慢性肾衰竭组、血管钙化组大鼠分别死亡1只,其余两组大鼠均存活,饲养36天后处死全部大鼠,取目的组织。1.2模型制备判断方法大鼠饲养5周(适应性喂养1周,模型制备+术后恢复共1周,给予刺激3周,共计5周)后,采血检测血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平,同时取动脉血测p H值、HCO3-浓度。1.3对大鼠主动脉的检测采用免疫组织化学染色方法检测大鼠主动脉Runx2及NFATc1的表达水平;采用von Kossa钙化染色法观察血管钙化情况;用钙含量测定试剂盒(邻甲酚酞络合酮比色法)按说明书方法测定主动脉钙含量。2细胞实验2.1细胞分组将VSMCs随机分为3组:正常对照组、高磷+p H7.4组、高磷+p H7.1组。使用盐酸和碳酸氢钠调整培养基p H值,每24小时换液一次。2.2采用茜素红染色方法判断VSMCs钙盐沉积情况;测定细胞钙含量。2.3 Western印迹法检测VSMCs目的蛋白的表达:干预4 d后提取细胞蛋白,测定NFATc1和Runx2蛋白的表达。细胞蛋白质经电泳分离以及转膜、封闭后,先后加一抗稀释液(NFATc1 1:1000,Runx2 1:500,GAPDH 1:5000)、二抗稀释液(1:5000),后显影、分析条带灰度值。3统计学方法应用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,若是符合正态分布的计量资料,则采用(?)±s表示,若是两独立样本均数比较,则采用t检验分析,多个样本均数比较用单因素方差分析,组间两两比较用S-N-K检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1酸对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响:von Kossa染色结果显示,假手术组、慢性肾衰竭组未见钙化发生,血管钙化组大鼠主动脉发生明显钙化,酸干预钙化组大鼠主动脉钙化明显比血管钙化组减少。钙含量测定结果显示,与假手术组相比,慢性肾衰竭组大鼠主动脉钙含量无明显增高(P>0.05),钙化组大鼠主动脉钙含量显著增高(P<0.05);与钙化组相比,酸干预组大鼠主动脉钙含量明显降低(P<0.05)。2酸对慢性肾衰竭大鼠Runx2表达的影响:Runx2免疫组织化学评分的结果显示,血管钙化组大鼠的Runx2的免疫组化评分比假手术组和慢性肾衰竭组升高;酸干预组Runx2评分低于血管钙化组。3酸对慢性肾衰竭大鼠NFATc1表达的影响:血管钙化组大鼠的NFATc1的免疫组化评分比假手术组和慢性肾衰竭组升高;酸干预组NFATc1评分低于血管钙化组。4钙化血管NFATc1表达与Runx2表达的相关性:相关分析显示,发生钙化的大鼠血管中NFATc1表达与Runx2表达呈正相关(r=0.877,P=0.000)。5酸性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs钙化的影响:细胞培养14d后,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组可见大量橘红色钙盐沉积;与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.1组细胞钙盐沉积减轻。钙含量结果与钙化染色相似,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组钙含量明显增多(P<0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.1组细胞钙含量明显减少(P<0.05)。6酸性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs表型转化的影响:Western印迹结果显示,同正常对照组相比,高磷+p H7.4组Runx2蛋白表达水平增加(P<0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.1组Runx2表达量明显减少(P<0.05)。ALP活性测定结果显示,高磷+p H7.1组ALP活性明显低于高磷+p H7.4组(P<0.05)。7酸性环境对高磷诱导的VSMCs NFATc1蛋白表达的影响及其与Runx2和ALP活性的相关性:正常对照组与高磷+p H7.4组NFATc1蛋白表达结果显示,高磷环境NFATc1表达升高;高磷+p H7.4组与高磷+p H7.1组NFATc1表达水平相比,高磷+p H7.1组NFATc1表达低于高磷+p H7.4组。相关分析显示,VSMCs中NFATc1表达与Runx2表达呈正相关(r=0.801,P=0.003),NFATc1表达与ALP活性亦呈正相关(r=0.698,P=0.002)。结论:酸抑制血管钙化的可能机制是通过下调NFATc1表达继而抑制血管钙化发生而发挥作用的。