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非酒精性脂肪肝(NAFLD)是除酒精及其他明确的肝损伤因素所引起的一种肝脏病理综合征,在过去的几十年中,中草药作为NAFLD的潜在治疗药物受到越来越多的关注。本课题组谨遵中医药基本理论和前人研究成果,在四君子汤原方基础上进行药材及用量的加减,组成新的复方中药-加味四君子汤(CHF)。本试验的目的是确定CHF对NAFLD的预防作用并探讨其作用机制,为后续NAFLD防治药物的研发提供新的思路。在本研究中,我们分别通过体内试验与体外试验两个方面探讨CHF对NAFLD的预防作用及其分子机制。一、在体内试验中:通过高脂日粮的饲喂来诱导小鼠NAFLD模型。选用50只健康雄性昆明小鼠,随机分为5组,其中对照组(CON)饲喂普通日粮,模型组(HFD)饲喂高脂日粮,CHF处理组在饲喂高脂日粮的同时通过灌胃方式用低浓度(HFD+L)、中浓度(HFD+M)和高浓度(HFD+H)CHF持续给药8 w。试验过程中每周对小鼠体重进行称量,试验结束后采集小鼠血液及肝脏;测定血液及肝脏中相关生化指标,并对ERs、NF-κB和SREBP-1c通路中关键蛋白及基因进行检测。二、在体外试验中:通过FFA对AML 12小鼠肝细胞的刺激来建立细胞模型。根据不同处理将试验分为5组:空白对照组(CON)不进行处理,模型组(FFA)细胞加入FFA进行诱导,CHF处理组在用FFA诱导的同时分别加入低浓度(FFA+L)、中浓度(FFA+M)和高浓度(FFA+H)CHF持续处理24 h。试验结束后收集细胞,对细胞内ERs、NF-κB和SREBP-1c通路中关键蛋白及基因进行检测。体内试验结果显示:1、不同浓度CHF的灌服对高脂饮食饲喂导致的小鼠肝脏空泡样变性、炎性浸润、脂沉积等病理变化具有改善作用。2、中浓度及高浓度CHF的灌服显著抑制了高脂饮食饲喂小鼠血清(P<0.001)及肝脏(P<0.05)中TC含量的增加。Western blot结果显示,与HFD组相比,各浓度CHF的灌服极显著抑制小鼠肝脏中SREBP-1c蛋白相对表达量的升高(P<0.001);同时,HFD+M(P<0.05)、HFD+H(P<0.001)组小鼠肝脏ACC1蛋白相对表达量以及HFD+L(P<0.05)、HFD+M(P<0.001)、HFD+H(P<0.001)组小鼠肝脏FAS蛋白相对表达量较HFD组显著下降。此外,各CHF灌服组小鼠肝脏内Fas、Acc1基因相对表达水平的变化与蛋白变化趋势基本一致。3、CHF的灌服能够改善小鼠肝脏内SOD、CAT活性及MDA水平的变化。Western blot结果表明,与HFD组相比,HFD+M(P<0.01)、HFD+H(P<0.01)组小鼠肝脏PERK蛋白相对表达水平极显著降低,HFD+L(P<0.01)、HFD+M(P<0.001)及HFD+H(P<0.001)组小鼠IRE1蛋白相对表达水平极显著降低,HFD+M及HFD+H组小鼠肝脏中CHOP蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。4、CHF的灌服对小鼠血清及肝脏内TNF-α、IL-6等炎性因子及AST、ALT等肝损伤指标的变化具有改善作用。Western blot结果表明,HFD+L(P<0.001)、HFD+M(P<0.001)和HFD+H(P<0.001)组小鼠肝脏中IKK-β蛋白相对表达量较HFD组极显著下降;高浓度CHF的灌服能够极显著抑制小鼠肝脏内NF-κB蛋白相对表达量的升高(P<0.05)。PCR结果显示,不同浓度CHF的灌服能够有效改善高脂饮食饲喂导致的小鼠肝脏内Iκb-α、Ikk-β基因相对表达量的变化。体外试验结果显示:CHF的处理能够有效预防FFA诱导细胞周围脂滴的沉积;同时,CHF显著抑制SREBP-1c通路中关键蛋白及基因的相对表达,有效抑制PERK、IRE1、CHOP蛋白相对表达量的变化;显著抑制细胞中NF-κB通路相关蛋白及基因相对表达量的变化。体外实验最终结果与体内实验基本一致。综上所述,我们通过体内试验与体外试验两个方面对加味四君子汤在NAFLD中的预防作用及其作用机制进行了研究,结果表明,加味四君子汤对小鼠NAFLD具有一定的预防作用,这种预防作用是通过对ERs、NF-κB和SREBP-1c途径中关键蛋白及基因的调控来实现的。