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目的:丹参酮ⅡA磺酸钠(DS-201)是传统活血化瘀中药丹参的主要有效成分丹参酮ⅡA经磺化成盐后形成的水溶性衍生物,是一种BKCa通道开放剂和血管扩张剂,已在临床上用于冠心病、心绞痛和心肌梗死等缺血性心脑血管疾病的治疗,它具有抗动脉粥样硬化、缩小心肌梗死面积、显著增加冠脉血流量,减慢心率,增加心肌收缩力等作用。DS-201作为一种水溶性药物,保证了在水相中的溶解性,但却限制了透过细胞膜的能力,从而影响到DS-201对靶细胞的胞内作用而降低了疗效。研究发现,DS-201的血管舒张作用与血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(BKCa通道)激活相关,其作用主要在细胞内发挥,细胞内给药比细胞外给药产生的作用大100多倍。脂质体作为药物载体根据投送目的,具有可将水溶性、脂溶性或两性药物递送到组织、细胞膜或细胞内等部位的优点,以提高药物治疗指数,降低药物毒性和减少药物副作用。本研究以脂质体为DS-201的传递载体,旨在将DS-201直接导入细胞,充分发挥DS-201的BKCa通道激活作用及血管舒张作用,以期提高DS-201的临床应用价值。方法技术的建立将在有效治疗药物的应用研究等方面有重要理论指导意义和实用价值,特别是在推广和扩大中药的应用中发挥重要作用。方法:⑴ds-201脂质体的制备及其优化筛选:(1)薄膜超声分散法制备ds-201脂质体。(2)超速冷冻离心法分离脂质体与游离的ds-201。(3)高效液相色谱法(hplc)测定ds-201的含量。(4)以泄漏率(lr)为主要评价指标,采用均匀设计法优化筛选出最优处方。⑵ds-201脂质体的物理特性评价:(1)采用透射电镜(tem)观察外观形态。(2)zeta电位及粒度分析仪测定脂质体zeta电位及其粒径分布。(3)以一个月前后包封率的变化即泄漏率来衡量ds-201脂质体的初步稳定性;采用冷冻干燥法制备ds-201脂质体的冻干制剂即前体脂质体来提高稳定性。⑶最优处方ds-201脂质体生物活性的体外评价:(1)制备装载绿色荧光蛋白(gfp)的ds-201脂质体,将其与hek-293细胞共培育后进行荧光成像实验。(2)采用膜片钳技术验证ds-201脂质体的bkca通道激活作用。hek293细胞转染人源血管平滑肌细胞(vsmcs)的bkca通道。分别比较ds-201原药组、空白脂质体组和ds-201脂质体对bkca单通道电流和bkca全细胞电流的作用。(3)采用离体微血管张力测定系统(dmt)验证ds-201脂质体的血管舒张作用,分别比较ds-201原药组、空白脂质体组和ds-201脂质体组给药后对血管收缩剂苯肾上腺素(pe)和前列腺素(pgf2α)引起的血管收缩的舒张效应。结果:⑴采用薄膜超声分散法制备,经均匀设计优化筛选出的最优脂质体配方是:大豆磷脂浓度5mg/ml,大豆磷脂与胆固醇的质量比4:1,探头超声时间25min,ds-201与胆固醇的体积比7:1。⑵(1)从tem图观察到最优处方脂质体呈圆球形或类圆形,结构较完整且分布较均一。(2)最优处方脂质体的平均粒径为206.93±4.10 nm(n=3),Zeta电位为-36.79±0.54 mV(n=3)。(3)最优处方脂质体的冻干制剂一个月内的泄漏率为4.64%。⑶(1)装载GFP的DS-201脂质体与HEK-293细胞共培育24 h后,在荧光显微镜下观察到细胞膜周围呈现绿色荧光。(2)DS-201脂质体组使单通道贴附式膜片下BKCa通道的开放概率从0.013±0.004增加至0.036±0.011(n=10,P<0.05,Vm=+40 mV);使全细胞膜片下BKCa通道的电流密度从23.2±4.4 pA/pF增加至66.0±15.2 pA/pF(n=6,P<0.05,Vm=+40 mV)。DS-201原药组和空白脂质体组给药前后BKCa通道电流的变化无明显差异。(3)DS-201脂质体对PE或PGF2α诱导大鼠肠系膜动脉血管收缩的抑制百分比约为60%,而原药对照DS-201则只产生约为20%的抑制率(n=6,P<0.05)。结论:本课题筛选的DS-201脂质体能成功地将DS-201导入细胞内,促进VSMCs上BKCa通道的激活及对PE或PGF2α预收缩大鼠肠系膜动脉血管产生明显抑制作用。该DS-201脂质体胞内传递系统提高了DS-201的生物利用度及其血管舒张效应。