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近年来,研究发现长链非编码RNA(long noncoding RNA;lnc RNA)广泛地参与基因表达调控,在发育、疾病的发生等过程中发挥着重要的作用。然而,目前还没有研究报道lnc RNA在肝纤维化发病过程中的作用。本研究旨在通过构建肝纤维化小鼠模型并利用基因芯片技术筛选纤维化肝组织中差异表达的lnc RNAs,从中确定一个差异显著且肝组织特异性表达的lnc RNA。阐明其在肝纤维化发生过程中的作用机制及与肝纤维化发生发展及预后的关系,为肝纤维化的诊断和治疗提供新靶点。方法1.构建四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化模型;通过对比模型鼠与正常对照鼠的肝脏外观表型、肝组织的天狼猩红染色、HE染色、羟脯氨酸含量测定、q RT-PCR、Western blot、免疫组织化学染色以及免疫荧光技术检测肝纤维化的各种指标确证建模成功。2.应用基因芯片技术筛选肝纤维化小鼠及正常小鼠肝组织中差异表达的lnc RNAs和m RNAs;并对芯片结果进行差异分析、GO分析、KEGG Pathway分析、lnc RNA-m RNA共表达分析、临近基因分析、同源性分析以及mi RNAs的靶点预测。3.根据差异分析和lnc RNA-m RNA共表达分析筛选出10个lnc RNAs,并在纤维化的肝组织、原代肝星形细胞、肝细胞、小鼠不同的器官组织中检测它们的表达水平,确保芯片的可靠并筛选出一个肝特异性表达,差异显著的lnc RNA-Liver Fibrosis Associated lnc RNA1(lnc-LFAR1)。4.验证lnc-LFAR1不具有编码功能;核浆分离提取RNA技术确定lnc-LFAR1在细胞中的定位;c DNA末端快速扩增技术(RACE)技术测定lnc-LFAR1的全长序列。5.以慢病毒为载体在分离的原代HSCs中过表达或敲低lnc-LFAR1的表达后,运用q RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微技术检测与HSCs激活和纤维化发生相关基因的表达量改变。6.以慢病毒为载体在小鼠原代HCs及小鼠肝细胞系AML12细胞中过表达或敲低lnc-LFAR1的表达后,运用q RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微技术检测与肝纤维化、细胞凋亡以及炎症发生相关基因的表达量改变。7.构建CCl4及胆管结扎(BDL)诱导肝纤维化小鼠模型,通过小鼠尾静脉注射以慢病毒为载体的lnc-LFAR1干扰序列体内确证lnc-LFAR1在肝纤维化发生过程中的作用。8.通过RNA干扰技术、染色质免疫沉淀(Ch IP)技术、荧光素酶报告基因技术确证转录因子Smad2/3对lnc-LFAR1的调节作用。9.过表达或沉默lnc-LFAR1表达后,运用q RT-PCR和Western blot技术,检测基因芯片结果中提示的与肝纤维化发病过程中密切关联的信号通路,例如TGFβ/Smad、Notch、MAPK1、NF-κB等信号通路的改变。10.运用核酸结合蛋白免疫共沉淀(RIP)技术、Ch IP技术检测lnc-LFAR1是否与转录因子Smad2/3或染色质重塑复合物组分结合。结果1.通过基因芯片技术,我们发现了一个全新的、尚未报道过的lnc RNA分子lnc-LFAR1。研究表明lnc-LFAR1是一个肝特异性表达的lnc RNA;在肝星形细胞和肝细胞内lnc-LFAR1也均有表达;尽管lnc-LFAR1在纤维化的肝组织中表达量减低;然而,在小鼠原代肝星形细胞培养激活过程中lnc-LFAR1表达明显增多;TGFβ刺激小鼠原代肝星形细胞(HSCs)和肝细胞(HCs)后lnc-LFAR1表达明显增多;与正常的小鼠原代肝星形细胞相比,肝纤维化小鼠的原代肝星形细胞(HSCs)内lnc-LFAR1表达也显著增多。2.研究发现,lnc-LFAR1促进HSCs的激活;促进促肝纤维化相关基因的表达。3.在原代HCs和小鼠肝细胞系AML12细胞中,敲低lnc-LFAR1的表达抑制TGFβ引起的促肝纤维化相关基因、促炎症相关基因表达水平的增高;敲低lnc-LFAR1的表达同时抑制TGFβ引起HCs凋亡。4.敲低lnc-LFAR1的表达抑制CCl4及胆管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化的发生。5.TGFβ通过促进转录因子Smad2/3结合于lnc-LFAR1的启动子区域,从而促进lnc-LFAR1的表达。6.Lnc-LFAR1通过促进Smad2/3的磷酸化以及转录,激活TGFβ-Smad2/3信号通路。7.Lnc-LFAR1通过促进Notch2、Notch3和Hes1的转录,从而激活Notch信号通路。8.细胞浆内的lnc-LFAR1通过促进TGFβR1与Smad2/3的结合,从而促进Smad2/3的磷酸化。9.细胞核内的lnc-LFAR1与转录因子Smad2/3结合,促进TGFβ-Smad2/3信号通路和Notch信号通路组分的基因转录,从而激活TGFβ和Notch信号通路。结论综上所述,我们发现了一个肝特异性表达的lnc RNA分子lnc-LFAR1。通过体内外实验证明lnc-LFAR1通过促进HSCs的激活和HCs的凋亡,从而促进肝纤维化的发生。机制上,细胞浆内的lnc-LFAR1通过促进TGFβR1与Smad2/3的结合,从而促进Smad2/3的磷酸化。而细胞核内的lnc-LFAR1与Smad2/3结合后促进Smad2/3结合于α-SMA,Col1α1,MMP2,TGF-β,Smad2,Smad3,Notch2和Notch3的启动子区域,从而促进这些靶基因的转录,激活TGFβ和Notch信号通路。通过深入探讨lnc-LFAR1在肝纤维化发生及发展过程中的重要作用,丰富了lnc RNAs的分子作用机制;同时也完善了lnc RNAs的基因调控网络。为肝纤维化的诊断和治疗提供新靶点。