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目的:尽早实行再灌注治疗是缺血性心脏病治疗的关键，然而，再灌注后可以引起缺血/再灌注损伤(IRI)。近年来研究表明内质网应激(ERS)在IRI的病理生理过程中发挥重要作用。药物预适应是缓解心肌IRI的有效措施，原花青素(PC)是一种强效的天然抗氧化剂，具有众多生物活性，如抗凋亡、抗肿瘤、保护心血管等作用。考虑到ERS在心肌IRI中扮演的重要角色，以及PC对心肌IRI的保护作用，我们设想内质网可能为PC减轻心肌IRI损伤的作用靶点。本研究以大鼠H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型为研究对象，第一部分研究观察PC对H/R损伤后心肌细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞凋亡程度以及ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达的影响，并探讨PC剂量效应关系;第二部分研究观察PC对H/R后细胞凋亡程度、信号转导子和激活子3(STAT3)通路、ERS及其相关凋亡通路蛋白和基因表达的影响，并观察应用STAT3特异性抑制剂Stattic处理后以上各参数的变化，探讨STAT3通路在PC保护H/R后心肌细胞损伤中发挥的作用，以及STAT3通路与ERS的关系及调控机制。 方法: 第一部分:1.建立缺氧/复氧模型，探索最佳复氧时间:H9C2心肌细胞（购自中科院上海细胞库）分为6组，分别为空白对照组、缺氧3h复氧1h组、缺氧3h复氧3h组、缺氧3h复氧6h组、缺氧3h复氧12h组、缺氧3h复氧24h组。缺氧培养时将培养基更换为无糖无血清、缺氧的DMEM培养基置于37℃充满95％N2和5％ CO2的三气培养箱内培养3h，然后更换为正常培养基，置于37℃、5％CO2培养箱分别行不同时间复氧，光镜下观察细胞形态，MTT检测细胞存活率，检测细胞LDH活性，确定最佳复氧时间nh。 2.观察PC对H/R后心肌细胞保护作用:H9C2心肌细胞分为6组:1）空白对照组;2）缺氧/复氧组（H/R组）:将细胞置于37℃、充满95％N2、5％CO2的三气培养箱内缺氧3h，然后更换DMEM培养基，放入37℃、充满95％空气、5％CO2的培养箱内按探索的最佳复氧时间复氧nh;3）缺氧/复氧+低剂量原花青素组（H/R+LPC组）:50μg/ml PC孵育细胞30min后行缺氧/复氧过程;4）缺氧/复氧+中剂量原花青素组（H/R+MPC组）:100μg/ml PC孵育细胞30min后行缺氧/复氧过程;5）缺氧/复氧+高剂量原花青素组（H/R+HPC组）:200μg/ml PC孵育细胞30min后行缺氧/复氧过程;6）缺氧/复氧+4-苯基丁酸钠组（H/R+4-PBA组）:1mM4-PBA孵育细胞30min后行缺氧/复氧过程。各组细胞处理后光镜下、透射电镜下观察细胞形态，MTT检测细胞存活率，检测细胞LDH活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，Westem blotting检测细胞GRP78蛋白表达水平。 第二部分:H9C2心肌细胞分为7组:1）空白对照组;2）原花青素组(PC组):H9C2心肌细胞正常培养，采用100μg/ml PC处理细胞30min;3）Stattic组（S组）:采用1μM Stattic处理细胞1h;4）缺氧/复氧组（H/R组）:将细胞置于37℃、充满95％N2、5％CO2的三气培养箱内缺氧3h，然后更换DMEM培养基，放入37℃、充满95％空气、5％CO2的培养箱内复氧nh;5）缺氧/复氧+原花青素组（H/R+PC组）:先给予细胞100μg/ml PC预处理30 min，再按H/R组过程行缺氧/复氧过程;6）缺氧/复氧+Stattic组（H/R+S组）:细胞缺氧/复氧前加入1μM Stattic预处理1h，再按H/R组过程行缺氧/复氧过程;7）缺氧/复氧+原花青素+Stattic组（H/R+PC+S组）:细胞经1μM Stattic预处理1h后，加入100μg/ml PC孵育30 min，再按H/R组过程行缺氧/复氧过程。各组细胞处理后MTT检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blotting检测细胞STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、GRP78、PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、CHOP、IRE1、磷酸化IRE1(p-IRE1)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、ATF6、Caspase-12蛋白的表达，Real-Time PCR检测细胞GRP78、PERK、CHOP、JNK、ATF6、Caspase-12 mRNA的表达。 结果: 第一部分:1、1）光镜下显示，对照组心肌细胞贴壁生长良好，细胞呈梭形或多角形，簇状生长，细胞折光性强。随着复氧的开始，细胞变圆、拉长，细胞折光性下降，存活细胞数目减少，圆形漂浮细胞增多，其中复氧3h、6h比复氧1h存活细胞明显减少，复氧3h、6h比较细胞形态差别不大，复氧12h、24h较3h、6h圆形漂浮细胞更多。2）与对照组相比，H/R组细胞存活率下降，复氧后3h、6h、12h、24h细胞存活率与对照组有显著差异(P＜0.01);复氧后3h、6h、12h、24h各组之间细胞存活率无统计学差异(P＞0.05)。3)与对照组相比，H/R组细胞LDH活性均明显上升(P＜0.01);复氧后3h、6h、12h各组细胞之间的LDH活性无统计学差异(P＞0.05);故选择复氧3h为后续实验H/R模型复氧时间。 2、1)光镜下显示，与对照组相比，H/R组细胞形态发生明显损伤变化，不同浓度PC预处理和4-PBA预处理可改善细胞形态的变化。2）透射电镜下显示，与对照组相比，H/R组心肌细胞出现明显损伤，表现为核膜缺损，线粒体肿胀、空泡化，内质网扩张，并出现大量凋亡小体;不同浓度PC预处理和4-PBA预处理可改善细胞超微结构形态的变化。3）与对照组相比，H/R组细胞存活率显著降低(P＜0.01);与H/R组相比，H/R+M/HPC组心肌细胞存活率显著提高（P＜0.01），H/R+LPC组细胞存活率升高不明显(P＞0.05)，其中H/R+MPC组细胞存活率提高最多;中、高剂量PC预处理组与4-PBA预处理组心肌细胞存活率无明显差异(P＞0.05)。4）与对照组相比，H/R组心肌细胞LDH活性明显升高(P＜0.01);与H/R组相比，不同浓度PC预处理组的LDH活性均明显降低(P＜0.05);不同浓度PC预处理组和4-PBA预处理组间LDH活性无明显差异（P＞0.05）。5）与对照组相比，H/R组心肌细胞凋亡和坏死数量显著上升（P＜0.01）;与H/R组相比，不同浓度PC预处理组心肌细胞凋亡及坏死出现不同程度的明显减少(P＜0.05)，中剂量PC组细胞凋亡减少最明显;中剂量PC预处理组心肌细胞凋亡率与4-PBA预处理组未见明显差异，而低、高剂量PC预处理组细胞凋亡率高于4-PBA预处理组(P＜0.05)。6)H/R组蛋白GRP78表达较对照组明显增加(P＜0.01)，不同浓度PC预处理组GRP78蛋白表达皆下降(P＜0.05);GRP78蛋白表达在H/R+MPC组与H/R+4-PBA组间无明显差异(P＞0.05)，而H/R+LPC、H/R+HPC组GRP78蛋白表达量稍高于H/R+4-PBA组（P＜0.05）。 第二部分:1、与对照组相比，PC组和S组细胞存活率、凋亡率、蛋白和mRNA表达皆无明显变化(P＞0.05，除外S组p-STAT3/STAT3表达低于对照组和PC组)，说明本实验中PC和Stattic药物浓度对心肌细胞无损伤。 2、与对照组相比，H/R组细胞存活率显著下降，凋亡率显著升高(P＜0.01)。与H/R组相比，PC预处理可显著提高细胞存活率、减少细胞凋亡(P＜0.01);应用了STAT3通路阻断剂后，PC的改善作用明显减弱（P＜0.01）。 3、与对照组相比，H/R组细胞p-STAT3/STAT3比值显著上升(P＜0.01)。与H/R组相比，PC预处理使STAT3磷酸化进一步增加(P＜0.01);给予STAT3特异性抑制剂Stattic后，PC激活STAT3磷酸化的作用被抑制(P＜0.01)。 4、与对照组相比，H/R组ERS及其凋亡通路相关蛋白和mRNA表达皆显著上升(P＜0.01)。与H/R组相比，PC预处理抑制了ERS及其凋亡通路相关蛋白和mRNA的表达（P＜0.01）;给予STAT3特异性抑制剂Stattic后，PC对H/R诱导的蛋白和mRNA高表达的保护作用被抑制(P＜0.01)。PERK、JNK的mRNA表达各组间无明显差异(P＞0.05)。 结论: 1、缺氧3h复氧3h为本实验中H9C2心肌细胞最佳H/R模型制备时间。 2、PC预处理可通过抑制ERS减少H/R引起的细胞损伤和凋亡，PC作用效果不随浓度增加而增大，本研究100μg/ml PC对H3h/R3h心肌细胞提供最佳保护作用。 3、心肌细胞H/R过程中，PC可激活STAT3信号转导通路。 4、PC可减轻心肌细胞H/R损伤后ERS及其凋亡通路作用所致凋亡，这种作用机制可能与STAT3通路被激活有关。