慢性炎症痛是一种由多种因素(包括创伤、细菌、病毒感染以及外科手术等)导致外周组织受损而引起的持续性的疼痛状态,是临床疼痛病症中最常见的类型之一。完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)常被用于制作各种慢性炎症痛模型,进行相关机理的基础研究。炎症痛产生的外周和中枢机制一直是国内外疼痛研究的热点。大量研究表明,许多外周和中枢结构以及多种化学物质参与了炎症痛的形成及调制过程。然而,目前对其确切的发病机制尚未完全明确。针刺临床实践在我国已有两千多年历史,具有疗效确切、副作用少、耗费小、操作简单等优点。国内外大量临床和基础研究表明,针刺可以有效缓解疼痛,并且具有穴位作用特异性等特点。为使针刺疗法在更大范围内得以推广和应用,国内外学者一直致力于针刺镇痛方面的机理研究,探索针刺的作用规律。但由于疼痛及镇痛机制的复杂性,针刺镇痛的机制目前也尚未完全明确。现代生物医学的研究揭示,来自外周的信息(如疼痛、镇痛信息)要在脊髓水平进行最初级、最关键的整合,这一过程主要依赖于脊髓背角神经元释放的神经递质。从这些神经递质的效应来讲,可分为兴奋性神经递质和抑制性神经递质两大类。这些神经递质的释放与效应,影响着相关神经元的兴奋性,进而也干预了传入信息在脊髓中的整合和传导,最终影响到特定的感觉在大脑皮质的形成。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物中枢神经系统(centralnervous system,CNS)中广泛分布的重要的抑制性神经递质之一,在脊髓背角有大量存在,通过GABA_A、GABA_B受体参与脊髓初级传入信息的突触前、后抑制,调节痛觉传递。目前对于脊髓GABA_B受体在疼痛中的调制作用已基本明确,而GABA_A受体在痛觉中的调制作用目前尚存争论;疼痛状态下GABA及其受体的表达也仍然存在争议。GABA_A受体是大部分麻醉药物作用靶点,其各个亚单位的药理作用的逐渐明确为研发新的特异性强而副作用少的麻醉镇痛药提供良好前景。因此,GABA_A受体在疼痛、镇痛机制的研究中越来越受到重视。综上所述,本课题拟通过应用小鼠完全弗氏佐剂性外周慢性炎症痛模型,首先明确电针对炎症痛小鼠痛阈的影响,然后比较不同穴位的电针镇痛的疗效差别,最后观察和分析脊髓GABA_A受体在小鼠CFA炎症痛及针刺对其缓解中的作用。实验结果如下:1小鼠完全弗氏佐剂性外周慢性炎症痛模型制作与评价1.1小鼠完全弗氏佐剂性外周慢性炎症痛模型制作选用雄性昆明小鼠,在右后脚掌部位皮下注射20μl CFA,使其局部产生红、肿、热、痛等炎性反应,建立外周佐剂性慢性炎症痛模型。对照组于同侧同部位注射等容积的生理盐水(normal saline,NS)。通过测量辐射热缩爪潜伏期(pawwithdrawal latency,PWL)和脚掌周径,观察痛阈改变及炎症肿胀程度,对模型进行评价。1.2模型鼠脚掌肿胀在安静状态下,双人合作测量小鼠脚掌周径。结果表明:与造模前脚掌周径比较,CFA注射24小时后致炎侧脚掌明显肿胀,且持续到造模后第21天;非致炎侧脚掌周径无明显变化。对照组(足底注射生理盐水)脚掌周径无明显改变。1.3模型鼠PWL异常缩短在安静清醒状态下,进行小鼠PWL测量。结果表明:与造模前PWL比较,CFA注射24小时后致炎侧PWL明显缩短,且持续到造模后第14天;非致炎侧PWL无明显改变。对照组(足底注射生理盐水)PWL无明显变化。2电针对小鼠完全弗氏佐剂性外周慢性炎性肿胀及炎症痛的作用2.1电针双侧下肢穴对炎性肿胀的影响本实验观察了造模后两周内隔日多次电针双侧“足三里”和“昆仑”穴对脚掌周径的影响。实验分为四组:生理盐水组(normal saline,Sln)、模型组(model,Mdl)、模型+电针组(Mdl+EA)和模型+假电针组(Mdl+sham EA)。结果表明:在造模后21天内,Mdl+EA组的脚掌周径始终维持在注射后第1天水平,与Mdl组、Mdl+sham EA组比较没有显著性差异。上述结果表明,隔日多次电针治疗没有明显缓解肿胀。我们继续观察电针对小鼠完全弗氏佐剂性外周慢性炎症痛的缓解作用。2.2单次电针双侧下肢穴对PWL的影响本实验观察了单次电针双侧“足三里”和“昆仑”穴对PWL的影响。实验分组同前。结果表明:与电针治疗前PWL比较,Mdl+EA组致炎侧PWL在治疗后30 min内明显延长,而Mdl+sham EA组PWL无明显改变。各组非致炎侧的PWL于整个观察过程中无明显改变。生理盐水组PWL无明显变化。2.3多次电针双侧下肢穴对PWL的影响本实验观察了造模后两周内隔日多次电针双侧“足三里”和“昆仑”穴对PWL的影响。实验分组同前。结果表明:给与1次电针后,Mdl+EA组致炎侧PWL开始翻转延长;4次后,PWL达到最高,接近Sln组水平,且持续至第14天观察结束。而给予假电针后PWL无明显改变。各组非致炎侧的PWL于整个观察过程中无明显改变。生理盐水组PWL无明显变化。2.4单次电针双侧上肢穴对PWL的影响本实验观察了单次电针双侧“手三里”和“内关”穴对PWL的影响。实验分为四组:模型+电针“手三里”和“内关”穴组(Mdl+EA‘Shou-san-li’&‘Nei-guan’)、模型+假电针组“手三里”和“内关”穴组(Mdl+sham EA‘Shou-san-li’&‘Nei-guan’)、模型+电针“足三里”和“昆仑”穴组(Mdl+EA‘Zu-san-li’&‘Kun-lun’)和模型+假电针“足三里”和“昆仑”穴组(Mdl+sham EA‘Zu-san-li’&‘Kun-lun’)。结果表明:与电针治疗前PWL比较,单次电针双侧“手三里”和“内关”穴组致炎侧PWL在治疗后30 min内无明显翻转延长。3脊髓GABA_A受体在小鼠完全弗氏佐剂性外周慢性炎症痛及针刺镇痛中的作用3.1鞘内注射GABA_A受体特异性拮抗剂对正常小鼠PWL的影响本实验观察了鞘内给予大剂量的GABA_A受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱bicuculline(Bic)对正常小鼠PWL的影响。小鼠鞘内埋管后第4天进行埋管位置鉴定,第5天开始进行实验。实验分为两组:正常对照组(Normal+i.t.Implantation),即正常小鼠仅给予埋管手术;正常给药组(Normal+i.t.0.05μg/5μlBic),即正常小鼠鞘内给予大剂量0.05μg/5μl Bic。结果表明:Normal+i.t.0.05μg/5μl Bic组在鞘内给药后的20 min内,PWL明显缩短,与给药前PWL比较有明显差异;且给药后10 min内的PWL与Normal+i.t.Implantation组比较有统计学差。3.2鞘内注射GABA_A受体特异性拮抗剂对模型小鼠PWL的影响本实验观察了鞘内给与不同剂量的GABA_A受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱bicuculline(Bic)对模型小鼠致炎侧PWL的影响。实验流程同上。实验分为八组:模型+鞘内注射生理盐水组(Model+i.t.NS)、模型+鞘内注射1μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.1μg/5μl Bic)、模型+鞘内注射0.1μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.0.1μg/5μl Bic)、模型+鞘内注射0.05μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.0.05μg/5μl Bic)、模型+鞘内注射0.02μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.0.02μg/5μl Bic)、模型+鞘内注射0.01μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.0.01μg/5μl Bic)、模型+鞘内注射0.05μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.0.005μg/5μl Bic)和模型+鞘内注射0.0025μg/5μl荷包牡丹碱(Model+i.t.0.0025μg/5μl Bic)。结果表明:Model+i.t.1μg/5μl Bic组与Model+i.t.0.1μg/5μl Bic组的模型小鼠在鞘内给予高剂量的Bic(1μg和0.1μg)后,表现出一系列烦躁不安疼痛样的行为学反应(颤抖,对外界刺激极度敏感等);其它剂量Bic组在鞘内给药后的100 min内的PWL与Model+i.t.NS组比较无明显差异。3.3鞘内注射GABA_A受体特异性拮抗剂对电针缓解小鼠佐剂性外周慢性炎症痛效应的影响本实验观察了鞘内大剂量(0.05μg/5μl)GABA_A受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱bicuculline(Bic)对模型小鼠电针后致炎侧PWL的影响。实验流程同上,电针后立即给药。实验分为四组:模型+鞘内注射生理盐水组(Model+i.t.NS)、模型+电针组(Mdl+EA)、模型+假电针组(Mdl+sham EA)和模型+电针+鞘内注射0.05μg/5μl Bic组(Model+EA+i.t.0.05μg/5μl Bic)。结果表明:与Mdl+EA组比较,Model+EA+i.t.0.05μg/5μl Bic组能够明显翻转电针治疗后明显升高的致炎侧的PWL。3研究结论:1.CFA作为一种抗原复合物,能够在注射部位局部产生明显的炎症反应而模拟临床上慢性炎症性疼痛。2.单次电针在短时间内(停针后30 min内)可以明显缓解小鼠CFA炎症性疼痛;隔日多次电针治疗,尽管最大镇痛强度与单次电针相近,但其作用的持续时间明显延长,具有明显的累加效应;针刺位于与病灶相同或邻近的脊髓神经节段的穴位的镇痛效果明显,在一定程度上,说明了穴位作用的特异性。3.鞘内给予GABA_A受体特异性拮抗剂对正常小鼠、电针后小鼠痛阈的改变,表明脊髓中枢内GABA_A受体可能参与了慢性炎症痛及针刺缓解炎症痛的过程中。