本课题的研究内容是通过在枯草芽孢杆菌中敲除rbsK基因,减少核黄素生产途径的副产物,进而考查对核黄素产量的影响。同时,敲除tkt基因即构建转酮酶缺陷菌株,使rbsK的敲除不至于引起其他副产物支路通量的增加,影响发酵结果。　　 rbsK基因在戊糖磷酸途径中表达核糖激酶,进一步催化D-核糖的生成。该基因的敲除理论上将造成D-核糖-5磷酸的积累。由于核黄素的生成需要两种直接前体物,其合成方程式为2DHPB+DARPP=Riboflavin,这两种前体物分别由核黄素生产的长途径和短途径提供,而D-核糖-5磷酸又是这两条途径必需的前体物。同时,为避免由于D-核糖生成支路的切断引起另一个方向酮糖生成支路通量的增大,减少不必要的副产物的生成,本实验设计方案敲除tkt基因。以rbsK基因的敲除为例:经PCR扩增得到的rbsK基因片段进行酶切,再与以同样内切酶切后的载体质粒pUC18在大肠杆菌中进行酶连,得到第一个重组质粒pUC18-rbsK;在pUC18-rbsK质粒的rbsK片段上选择合适的酶切位点进行酶切,再与同样酶切后的抗性基因(Spc、Kan抗性等)进行酶连,得到第二个重组质粒pUC18-rbsK-Spc或pUC18-rbsK-Kan,使rbsK基因不能完整表达而失活；构建成功的整合型敲除质粒pUC18-rbsK-Spc或pUC18-rbsK-Kan在枯草芽孢杆菌中双交换整合,利用插入的抗性基因对菌株进行抗性筛选,最终实现了在枯草芽孢杆菌中敲除rbsK基因的目的。同理,经一系列酶切、酶连、转化、筛选等操作后,在枯草芽孢杆菌中可实现tkt基因的敲除。　　 本实验主要在核黄素生产菌株RH33、RH44中敲除rbsK基因和tkt基因,基因操作完成后,对新构建的工程菌与出发菌株进行考察对比。首先利用LC-MS手段检测基因敲出前后菌株的相关代谢物,即D-核糖,一系列酮糖等的相对变化,结果显示,两个基因缺陷的菌株不再合成D-核糖,相关酮糖(以7磷酸-景天庚酮糖为检测目标)的产生量也有了较大程度的降低；摇瓶发酵后,发现两个基因的敲除对RH44的影响明显大于RH33。其中,两基因缺陷的工程菌RH44(R-Spc())摇瓶发酵72 h后,核黄素产量最高可达到4.98 g,比出发菌株提高了约14.5％。