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研究背景与目的:放射性肺损伤是电离辐射治疗胸部恶性肿瘤患者的常见并发症,严重影响肿瘤患者的治疗进展和生活质量,且目前对此缺乏特异性的防治药物。本课题组自主研发的重组鞭毛蛋白FlaAN/C,前期研究表明其能够产生高效的辐射防护作用,然防护机制尚不明了。细胞焦亡是一种新发现的促炎程序性细胞死亡方式,已被广泛证明在多种炎性疾病的发生发展中扮演重要角色,成为临床治疗的一个新靶点。本研究旨在明确辐射性损伤中炎性小体的参与情况,探讨FlaAN/C抑制辐射性细胞焦亡的有效作用靶点,为研发防治放射性损伤药物提供实验依据和潜在策略。方法:1.FlaA N/C减轻人肺上皮细胞辐射性损伤构建人肺上皮细胞(BEAS-2B)放射性损伤模型,通过CCK-8细胞活性实验和乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评价细胞受损情况,ELISA法检测细胞培养基中炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)的含量水平。2.细胞焦亡在FlaA N/C减轻辐射性BEAS-2B细胞损伤中的作用BEAS-2B细胞用半胱天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)特异性抑制剂(Z-YVAD-FMK,YVAD)和FlaA N/C蛋白处理2h后辐射。通过CCK-8活性实验和LDH释放水平检测实验评价处理后细胞的受损情况,caspase-1活性检测试剂盒检测处理后细胞的caspase-1活性。Western blot方法检测处理后细胞中IL-1β、IL-18、casp1 p20蛋白表达水平,ELISA法检测细胞培养基上清液中细胞因子IL-1β和IL-18分泌水平。3.FlaA N/C诱导NLRC4炎性体自噬BEAS-2B细胞用FlaA N/C蛋白处理后,荧光共定位与免疫共沉淀方法检测NAIP-NLRC4炎性小体形成情况及NAIP、Beclin-1与NLRC4的结合情况,免疫荧光检测LC3聚集情况,Western blot方法检测细胞中LC3蛋白的表达水平。网站“http://repeat.biol.ucy.ac.cy/iLIR/”预测NLRC4炎性体成分与LC3的结合位点;BEAS-2B细胞用FlaA N/C蛋白处理后,免疫荧光检测NAIP、NLRC4、与LC3共定位表达,Western blot检测细胞中NAIP、NLRC4、ASC、LC3蛋白的表达水平。4.NLRC4炎性体自噬对辐射性细胞焦亡发生的调控作用自噬抑制剂(spautin1)与FlaA N/C蛋白及si-NAIP预处理BEAS-2B细胞后辐射,Western blot法检测细胞中NLRC4炎性体组分和焦亡、自噬相关蛋白的表达水平,CCK-8细胞活性实验和LDH释放实验评价细胞辐射后受损情况,caspase-1活性检测试剂盒检测细胞辐射后的caspase-1活性,ELISA法检测细胞培养基上清液中炎性因子IL-1β和IL-18分泌水平。结果:1.当辐射剂量大于10Gy辐射BEAS-2B细胞。48h后,细胞受损程度明显。FlaA N/C预处理可以明显抑制辐射引起BEAS-2B细胞中IL-18、IL-1β的分泌,同时减轻BEAS-2B细胞放射性损伤的发生。2.当辐射剂量大于10Gy辐射BEAS-2B细胞。48h后,细胞中的casp1 p20、IL-1β、IL-18焦亡标志蛋白表达增高,细胞培养基中的IL-1β和IL-18分泌水平增高;免疫共沉淀实验结果显示,辐射后NLRP3、AIM2与ASC蛋白复合物增加;FlaA N/C预处理2h后辐射,BEAS-2B细胞中caspase-1活性降低,casp1 p20、IL-1β、IL-18焦亡标志蛋白表达降低;细胞培养基中的炎性因子IL-1β和IL-18的含量水平降低;BEAS-2B细胞的辐射损伤减轻。3.FlaA N/C(500pg/mL)处理组中casp1 p20、IL-1β、IL-18焦亡标志蛋白表达增加;FlaA N/C(50pg/mL)处理后,免疫共沉淀结果显示NLRC4炎性体复合物水平明显增加,免疫荧光结果显示FlaA N/C处理后LC3有明显的聚集,Western blot结果显示LC3II蛋白表达增加。4.与FlaA N/C处理组相比,FlaA N/C+spautin1组及FlaA N/C+si-NAIP组中NLRC4、ASC、NAIP的蛋白表达水平明显增高;网站“http://repeat.biol.ucy.ac.cy/iLIR/”预测NLRC4炎性体组分与LC3有多个结合位点;免疫荧光显示,FlaA N/C处理组中LC3与NLRC4、NAIP有明显的共定位表达。与FlaA N/C预处理后辐射相比,spautin1+FlaA N/C及si-NAIP+FlaA N/C预处理辐射后的焦亡标志蛋白水平增加,IL-18、IL-1β的分泌水平增加,细胞活性降低,caspase1的活性及LDH的释放水平明显增加。结论:1.NLRP3、AIM2炎性体介导的细胞焦亡在辐射引起的人肺上皮细胞损伤中发挥着重要作用;2.FlaA N/C通过促进NLRC4炎性体自噬,抑制辐射性细胞焦亡的发生,从而发挥辐射保护作用。