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背景： 类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以对称性多关节肿痛为主要临床表现的系统性、炎症性自身免疫疾病，发病率约为0.5％-1％，是造成人类劳动力丧失的常见原因。RA 在中医属于痹症的范畴，痹症有闭阻不通之意，涉及到肝气不疏，情志失调则可引起一系列神经精神症状，如头痛、抑郁、癫痫发作、认知功能下降等，其中比较常见的是轻度认知功能障碍（Mild cognitive impairment，MCI）。MCI是介于大脑正常衰老和早期痴呆之间的一种状态，是正常老龄化向阿尔茨海默病(AD)发展的过渡期，与年龄相匹配的正常人群相比，MCI患者发生痴呆的风险增加，目前研究认为 MCI以每年 10%～15%的概率向痴呆的转化，第 6 年转化率增长到约 80%。流行病学显示RA患者MCI患病率约为38%~71%,高于相匹配的健康对照组，MCI严重影响了RA患者的生活质量，造成了更多的功能限制。目前MCI的诊断多依靠量表筛查，尚未出现通用的实验室检查指标辅助MCI的诊疗，因此，本课题组采用同质异序标签技术（TandemMass Tags，TMT）联合二维液相色谱-串联质谱（two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MSMS）技术对合并MCI的RA患者的血清进行蛋白质组分析，拟寻找血液学标志物，辅助MCI的诊断。 目的： 1、筛选并发MCI的RA患者血清中的差异蛋白，寻找诊断RA患者MCI的血清标志物。 2、验证 TMT技术筛选出的差异蛋白，以评价 TMT技术的可靠性，并探讨该蛋白在RA患者MCI的发病中所起的作用。 方法： 1、筛选MCI的RA患者血清差异表达蛋白 选取MCI的RA患者、认知功能正常（Normal cognitive，NC）的RA患者、健康受试者各12例，收集清晨空腹外周血，离心，取血清。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检验血清样品的一致性。采用 TMT 技术进行定量蛋白质组学分析，首先对各组血清进行蛋白定量，随后去除各组血清样本中的高丰度蛋白，再还原、烷基化、酶解，用TMT试剂标记样本，样本混合之后进行强阳离子交换色谱分离，随后进行反向色谱-串联质谱分离和鉴定，将质谱分析产生的原始数据用Proteome DiscovererTM1.4软件进行处理，将实验串联质谱数据与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，可得到蛋白质鉴定结果，进而筛选出各组间差异表达的蛋白，进而对差异表达蛋白进行生物信息学分析。 2、验证MCI的RA患者血清差异表达蛋白 选取MCI的RA患者（A组）、NC的RA患者（B组）、健康受试者（C组）各12例，收集清晨空腹外周血，离心，取血清。通过 ELISA 检测上述 3 组受试者血清中的转甲状腺素蛋白（Transthyretin,TTR）、血清对氧磷酶1（Serum paraoxonase,PON1）、人音猬因子（Sonic hedgehog protein,SHH）含量。 结果： 1、MCI的RA患者血清差异表达蛋白筛选结果 1.1.神经心理学测试结果 MCI的RA患者组MoCA总分低于26分，且低于NC的RA组和健康受试组，差异具有统计学意义（p＜0.05），NC 的 RA 组和健康对照组的 MoCA 评分差异无统计学意义（p＞0.05）；三组PHQ-9、GAD-7评分均低于4分，且三组间评分差异无统计学意义（p＞0.05），排除了患者的焦虑抑郁，三组受试者日常生活能力评估量表（Activity of Daily Living Scale,ADL）评分均为20分,日常生活能力正常。 1.2.血清样品一致性检验结果 将各组血清样品用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），结果显示各组血清样品之间具有较好的一致性。 1.3.差异表达蛋白筛选结果 TMT联合 2D-LC-MSMS对MCI的RA患者、NC的RA患者、健康受试者血清进行差异蛋白筛选，将处理结果在蛋白质数据库里搜索并进行数据处理后，以倍数变化上调大于1.2或下调大于0.83认为是差异蛋白，总共鉴定出可信蛋白744个，动态变化中蛋白158个；MCI的RA患者组较NC的RA患者组有35个差异表达蛋白，其中在MCI的RA患者组表达上调的蛋白有 13个，表达下调的蛋白有 22个；MCI的RA患者组较健康受试组有109个差异表达蛋白，其中在MCI的RA患者组表达上调的蛋白有58个，表达下调的蛋白有51个；NC的RA患者组较健康受试组有70个差异表达蛋白，其在NC的RA患者组表达上调的有47个蛋白，表达下调的有13个蛋白。MCI的RA患者组较NC的RA患者组和健康受试组共有的差异表达蛋白有14个，其中在MCI的RA患者组表达上调的蛋白有8个，表达下调的蛋白有6个。 1.4.生物信息学分析结果 MCI的RA患者组较NC的RA患者组和健康受试组差异表达的14个蛋白的基因本体（Gene Ontology，GO）富集结果显示：共富集到706个生物过程（Biological Process,BP），42个细胞定位（Cellular Component,CC），39个分子功能（Molecular Function,MF）。生物学过程（BP）富集分析显示差异表达的蛋白主要与调节基质粘附依赖性细胞铺展（25％），血小板脱粒（40％），调节体液水平（40％）。在细胞成分（CC）组中，差异表达的蛋白质主要位于细胞外区域（92％）和细胞外膜结合的细胞器（55％）。在分子功能（MF）分类中，发现大多数差异表达的蛋白参与结合（90％），受体结合（40％）和羧酸酯水解酶活性（10％）。信号通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG Pathway）分析及富集结果显示：差异表达蛋白主要参与了补体和凝血级联反应、血小板活化、白细胞跨内皮转移、氮代谢、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢等相关的信号通路。蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPI）分析结果显示：FGL1， FGB，FGG，FGA和TTR蛋白与其他蛋白质之间有复杂的相互作用关系。 2、差异表达蛋白ELISA验证结果 2.1.三组中PON1、SHH、TTR表达量检测结果 与B组和C组相比，A组血清中SHH和TTR的表达分别上调和下调。差异具有统计学意义（p＜0.05），这与蛋白质组学分析结果一致。三组间血清PON1表达差异无统计学意义（p＞ 0.05）。 2.2.血清SHH、TTR含量与MoCA评分的相关性分析结果 SHH蛋白含量与MoCA认知评分成负相关（r=-0.388，P＜0.05），TTR蛋白含量与MoCA认知评分成正相关（r= 0.214，P＜0.05）。 结论： 1、本研究摸索并确立了TMT联合2D-LC-MSMS技术研究MCI的RA患者血清差异表达蛋白的实验技术路线，初步建立了MCI的RA患者血清中的差异表达蛋白数据库。 2、初步筛选了MCI的RA患者较NC的RA患者及健康人血清中的差异表达蛋白，并通过生物信息学分析找到了可能与RA患者MCI发病相关的信号通路，为深入研究RA患者MCI发病的机制打下基础。 3、SHH、TTR蛋白可能是MCI的 RA患者潜在的生物标志物，临床上除量表筛查外，联合检测上述蛋白也可能对RA患者MCI的诊断及预防提供帮助，提高诊断的敏感性及特异性。