【摘 要】
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研究背景及目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,在临床表现上,RA以侵蚀性、对称性关节炎为特征。RA的基本病理改变包括滑膜异常增生、骨质进行性破坏以及关节畸形。研究表明,自噬在RA的发病机制中起关键作用,RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast like synoviocytes,FLS）自噬水平增高是导致其异常增殖的关键因素,本研究通过体
【基金项目】
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国家自然科学基金项目81673875；
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研究背景及目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,在临床表现上,RA以侵蚀性、对称性关节炎为特征。RA的基本病理改变包括滑膜异常增生、骨质进行性破坏以及关节畸形。研究表明,自噬在RA的发病机制中起关键作用,RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast like synoviocytes,FLS）自噬水平增高是导致其异常增殖的关键因素,本研究通过体内外实验证实当归拈痛颗粒（DGNTG）通过调节UCHL3/FOXM1通路,抑制滑膜细胞自噬,从而发挥防治RA的作用。方法:1.当归拈痛颗粒对佐剂性关节炎（AA）大鼠的防治作用。通过灭活结合分支杆菌（Mtb）诱导AA大鼠动物模型。将大鼠分为正常组、AA模型组、当归拈痛颗粒（DGNTG）组、甲氨蝶呤（MTX）组,比较各组大鼠体质量、关节炎指数（AI）、踝关节和滑膜组织HE染色、踝关节micro-CT扫描评估骨质破坏。2.当归拈痛颗粒对AA大鼠滑膜组织自噬相关基因和蛋白的表达影响。利用qRT-PCR 和 WB、IHC 检测滑膜组织 LC3、Beclin 1、P62 的 mRNA 和蛋白的表达水平。3.当归拈痛颗粒对RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）自噬水平的影响。分离培养RA-FLS原代细胞,MTT检测细胞活力,透射电镜观察自噬小体,qRT-PCR 和 WB、IF 检测 RA-FLS 细胞 LC3、Beclin 1、P62 的 mRNA 和蛋白的表达水平,给予雷帕霉素（RAPA）和氯喹（CQ）后检测RA-FLS自噬流。4.当归拈痛颗粒对UCHL3/FOXM1通路的影响。4D-LFQ定量蛋白质组学筛选出去泛素化酶UCHL3,DGNTG干预后检测UCHL3、FOXM1的mRNA水平、蛋白水平和泛素化水平,验证UCHL3与FOXM1互作,敲减和过表达UCHL3后检测FOXM1的泛素化水平和LC3、Beclin 1、P62的表达水平。结果:1.当归拈痛颗粒可以有效改善AA大鼠关节炎症状。相较于AA模型组,DGNTG有效改善大鼠的一般状态,降低足趾容积和AI评分,抑制关节滑膜过度增殖及减少骨破坏。2.当归拈痛颗粒抑制AA大鼠滑膜组织自噬水平。qPCR、WB和IHC结果显示DGNTG抑制滑膜组织LC3、Beclin 1的mRNA和蛋白表达水平,升高P62的mRNA和蛋白表达水平。3.当归拈痛颗粒抑制RA-FLS细胞自噬水平。透射电镜显示DGNTG干预后自噬小体减少。qPCR、WB和IF显示DGNTG抑制RA-FLS细胞LC3、Beclin 1,升高P62的mRNA和蛋白表达水平。4.当归拈痛颗粒调控UCHL3/FOXM1通路抑制自噬。（1）DGNTG干预后UCHL3、FOXM1蛋白表达水平降低,FOXM1泛素化水平上升。（2）UCHL3与FOXM1互作,敲减/过表达UCHL3后FOXM1泛素化水平升高/降低。（3）敲减UCHL3后,LC3、Beclin 1表达水平降低,P62表达水平升高。过表达UCHL3后,LC3、Beclin 1表达水平升高,P62表达水平降低。结论:当归拈痛颗粒可以通过调节去泛素酶UCHL3/FOXM1通路抑制自噬改善类风湿关节炎。
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