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目的“血管生成拟态（VM）”是高侵袭恶性肿瘤与经典“肿瘤血管生成”完全不同、不依赖血管内皮细胞的全新肿瘤血管供血模式。胆囊癌作为手术切除率低、易复发转移、预后差的高恶性肿瘤，是否也存在VM，迄今未见报道。本研究通过人胆囊癌石蜡标本、体外细胞三维培养及其干预实验，初探胆囊癌是否存在VM，以及其形态学特征、分子机制、临床意义和NCTD对胆囊癌VM的影响和机制。方法①收集手术切除经病理确诊原发性胆囊癌、胆囊腺瘤、慢性胆囊炎石蜡标本74例、10例、10例和相关临床病理参数；应用HE染色、CD31和PAS双重染色，观察胆囊癌是否存在VM，并作临床病理参数相关分析、Cox分析、Kaplan-Meier曲线绘制。②通过体外细胞二维培养、Transwell小室侵袭实验、胶原收缩实验、细胞毒实验及CD31免疫荧光检测，明确GBC-SD、SGC-996细胞侵袭、迁移潜能，NCTD IC50及HUVEC细胞鉴定。在此基础上，通过鼠尾Ⅰ型胶原三维培养进行胆囊癌VM体外模拟实验和药物干预实验，实验分GBC-SD细胞对照组、SGC-996细胞对照组、TIMP1组、TIMP2和NCTD组，应用HE和PAS染色、光学和电子显微镜观察三维培养组织切片体外模拟VM形态学。③应用SABC、Envision法免疫组化和ELISA放免方法测定人胆囊癌石蜡切片、三维培养组织切片和二、三维培养上清液中VM相关分子MMP1、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF、VE-cad和Ⅳ胶原蛋白表达，RT-PCR测定胆囊癌细胞表达内皮细胞相关基因。结果①在74例人胆囊癌中发现13.5％（10／74）存在VM，胆囊癌VM与病人性别、年龄、肿瘤部位、瘤体大小、分化程度、Nevin分期、浸润深度、局部淋巴转移无关；但与组织类型（χ2=10.241，P=0.017），生存期（χ2=5.7221，P=0.0168）有关，可能由于VM（+）阳性标本少，本组胆囊癌VM和肝脏转移无显著相关。②GBC-SD和SGC-996细胞的NCTD IC50分别为56.18μg·ml-1和22.66μg·ml-1，GBC-SD细胞体外穿过Transwell小室侵袭能力（P=0.0013）和收缩迁移能力（P＜0.001）明显高于SGC-996细胞，故GBC-SD、SGC-996细胞分属高、低侵袭潜能细胞株。经HE和PAS染色，高倍、倒置光相差显微镜观察，鼠尾Ⅰ型胶原和Matrigel胶三维培养GBC-SD细胞密集如癌巢，48h即形成以肿瘤细胞为内衬的基质型单环或多环中央空洞网络状管道结构，14d管腔成熟；而低侵袭性SGC-996细胞始终未形成模拟VM的管道状结构。③相关分子表达，对胆囊癌石蜡切片检测显示：VM（+）、VM（-）胆囊癌细胞MMP1、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF表达明显高于胆囊腺瘤、胆囊炎（P＜0.0001），VE-Cad、Ⅳ型胶原明显低于胆囊腺瘤、胆囊炎（P＜0.0001）；VM（+）胆囊癌MMP2（F=5.74，P=0.0187）、MT1-MMP（F=8.78，P=0.0039）表达明显高，而VEGF（F=5.78，P=0.0182）、Ⅳ型胶原（F=5.80，P=0.0181）明显低于VM（-）胆囊癌，MMP2、MT1-MMP与胆囊癌VM呈正相关，VEGF、Ⅳ型胶原与胆囊癌VM呈负相关；VM（+）胆囊癌MMP1（F=0.27，P=0.6082）、MMP9（F=2.80，P=0.0976）、VE-Cad（F=1.37，P=0.2450）表达与VM（-）胆囊癌无差别。对三维培养组织切片检测显示：GBC-SD细胞MMP1、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF表达明显高于SGC-996细胞。MMP-1在VM（-）组表达与分化程度、Nevin分期、淋巴结转移、肝脏转移密切相关，并随分化程度越低、Nevin分期越晚（S3～S5）、淋巴结及肝脏转移表达量增加，有显著差异（P＜0.05），在VM（+）组与临床病理指标无关（P＞0.05），同为肝脏转移组，VM（+）组MMP-1表达显著高于VM（-）组（P＜0.05）。MMP-2在VM（-）组表达与浸润深度、分化程度、Nevin分期、淋巴结转移、肝脏转移密切相关，并随侵及浆膜、分化程度越低、Nevin分期越晚（S3～S5）、淋巴结及肝脏转移表达量增加，有显著差异（P＜0.05），在VM（+）组与临床病理类型腺癌有关（P＜0.05），同为淋巴结、肝脏转移组、中低分化腺癌、浸润深度，Nevin分期（S3～S5），VM（+）组MMP-2表达均显著高于VM（-）组（P＜0.05）。MMP-9在VM（-）组表达与浸润深度、Nevin分期、淋巴结转移、肝脏转移密切相关，并随侵及浆膜、分化程度越低、Nevin分期越晚（S3～S5）、肝脏转移表达量增加，有显著差异（P＜0.05），在VM（+）组与浸润深度、Nevin分期、肝脏转移有关，并随侵及浆膜、Nevin分期越晚（S3～S5）、肝脏转移表达量增加，有显著差异（P＜0.05），同为侵及浆膜组，腺癌，Nevin分期（S3～S5）、肝脏转移，VM（+）组MMP-9表达均显著高于VM（-）组（P＜0．05）。MMP-14在无论VM（-）组和VM（+）组其表达与浸润深度、Nevin分期、淋巴结转移、肝脏转移密切相关，并随侵及浆膜、Nevin分期越晚（S3～S5）、肝脏转移表达量增加，有显著差异（P＜0.05），同为侵及浆膜组，Nevin分期（S3～S5）、淋巴结及肝脏转移，VM（+）组MMP-14表达均显著高于VM（-）组（P＜0.05）。VEGF在VM（-）组表达与浸润深度、Nevin分期、淋巴结转移、肝脏转移密切相关，并随侵及浆膜、Nevin分期越晚（S3～S5）、肝脏转移表达量增加，有显著差异（P＜0.05），在VM（+）组仅肝脏转移组表达明显高于无肝脏转移，有显著差异（P＜0.05）。同一病理指标下，VM（-）组和VM（+）组表达VEGF无差异（P＞0.05），VE-cad在VM（-）组表达与浸润深度、Nevin分期、淋巴结转移、分化程度相关，并随侵及浆膜、Nevin分期越晚（S3～S5）、淋巴结转移、分化差表达量减少，有显著差异（P＜0.05），在VM（+）组与临床病理指标无关（P＞0.05），同一病理指标下，VM（-）组和Ⅷ（+）组表达VE-cad无差异（P＞0.05），Ⅳ胶原在VM（-）组表达与浸润深度、Nevin分期、分化程度、肝脏转移相关，并随侵及浆膜、Nevin分期越晚（S3～S5）、肝脏转移、分化差表达量减少，有显著差异（P＜0.05），在VM（+）组Ⅳ胶原表达与浸润深度、分化程度相关，并随侵及浆膜，分化差表达量减少，有显著差异（P＜0.05），同为淋巴结肝脏转移，VM（+）组Ⅳ胶原表达均显著低于VM（-）组（P＜0.05）。二、三维培养上清液ELISA检测显示：三维培养GBC-SD细胞MMP2蛋白表达较三维SGC-996细胞、二维GBC-SD明显增高（P＜0.05），而三维培养GBC-SD细胞MMP9蛋白表达较三维SGC-996细胞、二维GBC-SD增高不显（P＞0.05），RT-PCR显示具有Ⅷ能力的GBC-SD可以强表达内皮细胞相关基因，而SGC-996仅弱或不表达④应用NCTD后，鼠尾Ⅰ型胶原三维培养48h，GBC-SD细胞即丧失形成单环或多环网络样结构能力，细胞稀疏、浮起、固缩，或聚集、核固缩碎裂，细胞凋亡、坏死；TIMP2则起这种作用的时间明显延迟，TIMP1无此作用。表明，NCTD有抑制体外模拟胆囊癌VM能力，TIMP2，TIMP1无阻止体外模拟胆囊癌VM能力。通过三维培养组织切片和上清液检测，1／2CI50NCTD不仅使MMP2、MT1-MMP，而且使MMP1、MMP9、VEGF阳性的GBC-SD细胞减少、染色变浅，蛋白表达下降；且随时间延长，GBC-SD细胞MMP2、MMP9蛋白表达明显受抑制（P＜0.05），表明，NCTD不仅有效抑制GBC-SD细胞MMP2、MT1-MMP，而且抑制MMP1、MMP9、VEGF、RT-PCR显示NCTD可以有效抑制ANG-1、ANG-2、EPHA2、VEGF表达，从而通过多靶点作用抑制和破坏体外模拟胆囊癌VM的形成和成熟。结论人原发性胆囊癌存在VM；胆囊癌VM与组织学类型、生存期相关。高侵袭潜能GBC-SD细胞在三维培养中具有形成以癌细胞为内衬的单环或多环网络结构的体外模拟VM能力。其分子机制涉及MMP2、MT1-MMP，VEGF、EPHA2、Ⅳ型胶原等相关分子。NCTD可有效抑制体外模拟胆囊癌VM；其机制可能与NCTD通过多靶点抑制上述相关分子表达，从而发挥阻遏、破坏形成体外模拟胆囊癌VM的作用。