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第一部分microRNA-204调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化目的：动脉中膜钙化是一种常见的大血管病变,它起始于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)向成骨样细胞分化的主动调节过程。目前调控这一过程的具体机制还不清楚。特定的microRNA可能通过表观遗传学途径调节血管平滑肌细胞向成骨样细胞(osteoblast-like cells)分化。在本实验中,我们主要探讨miR-204是否参与调节血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。方法：以β-甘油磷酸钠干预小鼠原代血管平滑肌细胞,以实时定量PCR检测miR-204表达水平的改变,以蛋白免疫印迹杂交检测Runx2表达水平的改变。以miR-204mimics和inhibitor转染小鼠血管平滑肌细胞,以蛋白免疫印迹杂交检测Runx2表达水平的改变,并检测以β-甘油磷酸钠诱导后成骨性标志物ALP和OC及Runx2蛋白表达水平的改变。将野生型/突变型Runx23’-UTR与miR-204mimics共转染小鼠血管平滑肌细胞,以荧光素酶报告基因策略验证Runx2是否为(?)niR-204的直接作用靶点。结果：β-甘油磷酸钠诱导下小鼠血管平滑肌细胞发生成骨样细胞分化,其miR-204表达水平受抑制而Runx2表达水平上调。以miR-204mimics转染小鼠血管平滑肌细胞能降低Runx2蛋白水平并抑制β-甘油磷酸钠诱导的成骨样细胞分化,而以miR-204抑制剂转染的小鼠血管平滑肌细胞能上调Runx2蛋白水平并增强β-甘油磷酸钠诱导的成骨样细胞分化,提示在血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中miR-204为Runx2的内源性抑制剂。通过荧光素酶报告基因策略验证Runx2为miR-204的直接作用靶基因。结论：miR-204表达水平的下调,从而上调Runx2蛋白表达水平为β-甘油磷酸钠诱导下血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化发生的始动因素。miR-204为血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中关键的调节因子。目的：血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨样细胞分化在许多血管钙化疾病的病理过程中起关键作用。近期研究表明,(?)nicroRNA(miRNA)参与调节血管平滑肌细胞钙化过程。本研究的目的在于探寻在血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中起关键调节的作用的新的miRNA。方法：从小鼠原代血管平滑肌细胞抽提小RNA。经过Poly(A)加尾并连接5端接头后逆转录为cDNA,随后进行PCR扩增、回收,连接至pcDNA3.1TOPO载体构建小分子RNA的cDNA文库,最后进行菌落PCR,得到阳性克隆送测序,经生物信息学分析确定新的miRNA (miR-X),并以Northern (?)(?)记杂交验证。以生物信息学方法预测miR-X的作用靶基因。通过转染miR-X前体(功能获得研究)和miR-X抑制剂(功能缺失研究)调节miR-X的表达水平。测定转染前后血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化程度和靶基因表达水平的改变。结果：我们发现了主要表达于血管平滑肌细胞的新miRNA——-miR-X,并发现它的表达水平在血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中表达减少。转染pre-miR-X能减少β-甘油磷酸钠诱导血管平滑肌细胞ALP活性、骨钙素分泌、Runx2蛋白表达和矿化水平,而转染miR-X抑制剂能增加血管平滑肌细胞ALP活性、骨钙素分泌和Runx2蛋白表达水平。通过靶基因预测软件预测FosB为niR-X的直接作用靶基因。miR-X过表达能下调FosB蛋白表达水平,对FosBmRNA表达水平却无影响。结论：miR-X表达水平的下调通过作用于靶基因FosB参与调节β-甘油磷酸钠诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程。目的：血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的凋亡在心血管疾病中的血管重塑方面起重要的调控作用。Apelin是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,在心血管系统中发挥重要作用。但是apelin是否参与调节血管平滑肌细胞凋亡过程仍未可知。本实验将以人原代血管平滑肌细胞为模型,探讨apelin对人血管平滑肌细胞凋亡的作用及参与调节的信号通路。方法：以Western免疫印迹检测APJ在血管平滑肌细胞中的表达水平。以血清饥饿法诱导血管平滑肌细胞凋亡,以apelin重组蛋白干预细胞,以细胞凋亡ELISA检测法及TUNEL法检测细胞凋亡水平。以siRNA沉默血管平滑肌细胞APJ的表达后,再检测apelin对细胞凋亡的影响。以Western免疫印迹检测apelin对Bcl-2、Bax蛋白及MAPK、Akt磷酸化水平的影响,再检测使用相应的信号通路阻断剂及APJ的siRNA后信号通路的激活及细胞凋亡水平的变化。结果：Western免疫印迹检测出APJ在人原代血管平滑肌细胞中表达。Apelin能抑制血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞凋亡。通过siRNA沉默APJ的表达能阻断apelin的抗凋亡作用。apelin上调Bcl-2的表达,下调Bax的表达。apelin还能激活ERK (extra-cellular signal-regulated protein kinase,细胞外信号调节蛋白激酶)和Akt(磷脂酰肌醇-3-激酶下游效应物)信号通路。APJ的siRNA能阻断apelin诱导的ERK和Akt的活化水平。LY294002(磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂)能阻断Akt的活化和apelin(?)勺抗凋亡作用。结论：Apelin能抑制血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞凋亡,这种抗凋亡的作用是通过APJ/PI3-K/Akt信号通路介导的。