目的：本研究旨在体外分离培养和鉴定人脐带间充质干细胞（humanumbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs），初步鉴定UCMSCs的生物学特性；探讨人脐带间充质干细胞旁分泌物的收集方法；探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSC）分泌物在体外对肝细胞再生、凋亡及其功能的影响。　　 方法：（1）无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带，利用PBS冲洗脐动脉及脐静脉，将血液冲洗干净，将其剪碎至1mm3后，加入0.1％Ⅳ型胶原酶消化60分钟，然后加入0.25％胰酶消化30分钟，利用滤网过滤后收集细胞，DMEM（5％FBS）重悬细胞接种于培养瓶内进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后进行1:3传代培养，取传代培养细胞进行形态学观察、流式细胞仪检测、生长活性检测、细胞周期分析；（2）制备含UCMSC分泌物的MSC条件培养基（Conditioned medium，MSC-CM），将UCMSC培养至第五代，待细胞70％至80％融合时，充分洗涤培养瓶，倒入15mL，含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM，24小时后收集此培养基，用3kDa的离心超滤管浓缩22倍，把浓缩后的培养基定义为100％浓度的MSC的条件培养基。2％MSC-CM（2％MSC-CM+98％肝细胞培养基），8％MSC-CM（8％MSC-CM+92％肝细胞培养基）。（3）采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞，取SD大鼠，乙醚麻醉、肝素腹腔注射抗凝，无菌常温环境下固定于操作台，剪开肌层，门静脉插管，剪断下腔静脉，用D-Hanks液灌洗净血管内血液，更换0.1％Ⅳ型胶原酶，灌洗10-20分钟至肝质变软，压之凹陷不易恢复后，撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合细胞悬液，筛网过滤，500rpm离心，去上清，收集肝细胞，根据试验需求接种于相应培养基培养。0.4％台盼蓝染色判断肝细胞活性；实验分组：对照组、2％MSC-CM组和8％MSC-CM组。（4）MTT比色法观察不同浓度MSC-CM对正常肝细胞增殖的影响：肝细胞接种于基底膜基质铺底的96孔培养板，培养24小时后，移去含10％胎牛血清的肝细胞培养基，然后加入含0.4％胎牛血清的DMEM培养基继续培养24小时，使细胞同步化于G0期，移去培养液，加入含5％胎牛血清及含不同浓度MSC-CM的肝细胞培养液，继续培养24小时。MTT比色法检测肝细胞增殖情况。（5）不同浓度MSC-CM对正常肝细胞功能的影响：肝细胞接种于12孔培养板，加入不同浓度的MSC-CM，24小时后收集培养上清液，Albumin Assay Kit和Urea Assay Kit测定不同浓度MSC-CM组的肝细胞上清液中白蛋白、尿素的浓度。（6）诱导肝细胞凋亡、MSC-CM处理及肝细胞活性分析：肝细胞在基底膜基质预铺底的12孔板内常规培养5天后，在培养基内加放线菌素D（0.2μg/mL）1小时，然后加入肿瘤坏死因子α（30ng/mL），诱导肝细胞凋亡，与此同时2％MSC-CM组和8％MSC-CM组分别加入相应浓度的MSC-CM，培养8小时后观察肝细胞活性。　　 结果：（1）利用胶原酶及胰酶两步消化法能充分消化脐带，细胞易于获得，收集细胞后进行原代培养，24小时可观察到贴壁细胞，待生长至10天时可见细胞长满瓶底，进行传代培养，每周传代1次。观察细胞形态为长梭形，不规则形，细胞大小不一，类似成纤维细胞，呈漩涡样生长。取第5-9代细胞经流式细胞仪检测表达CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，基本不表达造血细胞标志CD34、CD45，内皮细胞标志CD31。MTT实验显示细胞倍增时间为23h。细胞周期分析表明75％-85％细胞处于G0/G1。浓缩后的MSC-CM中含有高浓度的脐带间充质干细胞旁分泌物。（2）MTT法测定肝细胞增殖，与对照组比较，2％MSC-CM组吸光度（A）540nm值明显增加（P<0.01），而8％MSC-CM组与对照组相比，差异无统计学意义。测定2％MSC-CM组尿素和白蛋白的含量均高于其他两组（P<0.01），而对照组和8％MSC-CM组比较无统计学差异。细胞活性分析试剂盒检测，2％MSC-CM组肝细胞存活率增加（P<0.05），而8％MSC-CM组与对照组相比，差异无统计学意义。　　 结论：经酶消化法从脐带中获得的间充质干细胞，易于收集，体外增殖能力强，符合间充质干细胞基本的生物学特性，有望在干细胞的研究及临床应用方面发挥重要的作用。MSC分泌物易于收集，临床应用非常便利。低浓度的脐带间充质干细胞分泌物具有刺激正常肝细胞再生，抑制受损肝细胞凋亡，改善肝细胞功能等作用，为FHF的治疗提供了一种新思路。而高浓度的脐带间充质干细胞分泌物不具有上述作用，并不是间充质干细胞分泌物的浓度越高，其对肝细胞刺激再生、抑制凋亡的作用就越大。