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自2015年以来,由禽腺病毒4型（Fowl adenovirus 4,FAdV-4）引起的肝炎-心包积液综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS）以及与禽腺病毒8b型（Fowl adenovirus 8b,FAdV-8b）和禽腺病毒11型（Fowl adenovirus 11,FAdV-11）相关的包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）疫情在我国鸡群中持续流行,给我国养禽业造成了严重经济损失。流行病学调查显示,FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11为感染我国鸡群的主要血清型,且临床混合感染十分常见,但目前尚没有针对这三种血清型感染的三价疫苗。本研究从福建省某鸡场送检的临床病料中分离了一株FAdV-11FJSW/2021,测定了其全基因组序列并进行了遗传进化分析,研究了此分离毒株的生物学特性。在前期利用FAdV-8b的Fiber替换FAdV-4的Fiber-1构建了rFAdV-4-fiber/8b,并研发了基于rFAdV-4-fiber/8b的二价灭活疫苗,本研究将FAdV-11 Fiber基因插入到重组病毒rFAdV-4-fiber/8b基因组的1966-bp自然缺失区,构建了同时表达FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白的重组病毒rFAdV-4-fiber/8b+11。FAdV-4-fiber/8b+11具有与亲本FAdV-4相似的体外复制能力和对SPF易感鸡的致病性。单剂量灭活的rFAdV-4-fiber/8b+11疫苗免疫即可产生针对FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11的特异性抗体免疫反应,并对FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11感染提供了有效的临床保护。本研究为研发同时防控HHS和IBH的三价疫苗奠定了基础。研究内容包括以下四个方面:1.FAdV-11中国流行株的分离鉴定与基因进化分析为研究FAdV-11的遗传变异情况,本试验从临床疑似患包涵体肝炎的病鸡肝脏中分离到一株FAdV-11毒株FJSW/2021;FJSW/2021的全基因组序列测定结果显示,病毒基因组全长44154bp,基因组构成与已经报道的FAdV-11高度一致,遗传进化分析显示FJSW/2021与国内外已发表FAdV-11分离株全基因组的核苷酸序列同源性在97.68%-99.97%之间,均属于FAdV-11。FJSW/2021的p TP蛋白有6处氨基酸的增加;与加拿大非致病性毒株ON NP2同源性为99.97%,在100K和33K编码区出现了氨基酸的增加;对主要结构蛋白Fiber、Hexon和Penton的氨基酸序列比对分析发现,FJSW/2021毒株与国内毒株HBQ12、非致病毒株ON NP2一致;但编码三个蛋白的氨基酸序列与澳大利亚分离株、巴基斯坦分离株均有较大差异。本试验成功分离到一株FAdV-11,并测定了其全基因组序列,研究结果提示中国FAdV-11毒株可能具有相同的起源,且在不断演变,丰富了中国FAdV-11分离株的分子流行病学和遗传多样性知识,为研发相关疫苗奠定了基础。2.FAdV-11中国流行株FJSW/2021的体外增殖和致病性研究为进一步研究FAdV-11中国流行株FJSW/2021的体外增殖特性,利用病毒滴度测定的方法,研究该毒株在鸡肝癌细胞系LMH上的增殖规律。研究结果表明FAdV-11中国流行株FJSW/2021可以在LMH进行增殖,并引起细胞病变。感染LMH细胞12 h后,病毒滴度开始上升,感染后96 h病毒滴度达到峰值105.3TCID50/100μL,之后进入平台期。分别将10~6和10~7 TCID50的FAdV-11中国流行株FJSW/2021经过肌肉注射途径感染1周龄和2周龄SPF鸡,结果显示,1周龄死亡率为100%,2周龄死亡率为40%-50%,病死鸡均表现出相似的IBH症状,提示此毒株对不同日龄易感鸡的致病性存在差异。本试验为建立FAdV-11感染动物模型和评价相关疫苗的免疫效力提供了指导。3.同时表达FAdV-8b/-11 Fiber蛋白的重组rFAdV-4-fiber/8b+11的构建与鉴定流行病学显示FAdV-4、FAdV-8b、FAdV-11是引起我国HHS和IBH的主要血清型,为研发有效防控HHS和IBH的三价疫苗,本研究利用FAdV-4反向遗传系统,将FAdV-11 Fiber基因插入前期构建好rFAdV-4-fiber/8b基因组中的1966-bp自然缺失区,构建感染性克隆并成功拯救出重组病毒rFAdV-4-fiber/8b+11。通过PCR和Western Blot试验对rFAdV-4-fiber/8b+11进行鉴定,试验结果表明,FAdV-11 Fiber成功插入并成功表达,重组病毒传代稳定性良好。重组病毒与亲本毒株在LMH上有相似的增殖特性,将重组病毒和亲本毒FAdV-4感染2周龄SPF鸡,重组病毒感染组表现出典型的HHS剖检病变,死亡率低于FAdV-4感染组,对各器官组织进行病毒载量测定,均显著高于未感染组。本研究构建的同时表达FAdV-8b/-11 Fiber蛋白的重组rFAdV-4-fiber/8b+11为研发同时防控HHS和IBH的三价疫苗奠定基础。4.基于rFAdV-4-fiber/8b+11的三价灭活疫苗免疫原性和免疫效力评估为了评价基于rFAdV-4-fiber/8b+11制备的三价灭活疫苗的免疫原性和免疫效力,对一周鸡通过肌肉注射的方式进行免疫。免疫后每周利用ELISA测定免疫后的鸡体内抗FAdV-4/-8b/-11的抗体水平。结果表明,灭活疫苗可诱导产生针对FAdV-4/-8b/-11的特异性抗体。免疫后2周利用FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11分离株进行攻毒试验,结果显示,rFAdV-4-fiber/8b+11作为灭活疫苗可提供针对FAdV-4/-8b/-11感染的完全保护。研究结果提示rFAdV-4-fiber/8b+11可以作为种毒制备同时预防FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11感染的高效三价疫苗。