论文部分内容阅读
目的 研究临床分离的59株耐头孢西丁大肠埃希菌整合子的结构、分布及其在耐药基因播散中的作用;检测是否有孔蛋白及其基因OmpF缺失;进一步探明整合子及孔蛋白OmpF对大肠埃希菌耐药表型的影响,以指导临床抗生素的选择及耐药流行情况的监测。方法1)设计一种第一、二和三类整合酶基因(int Ⅰ)的简并引物,应用PCR方法对临床分离的59株耐头孢西丁的大肠埃希茵进行整合酶基因筛选。2)对于整合酶基因阳性的菌株,再利用限制性片段长度多态性技术(RFLP)进行分型。3)PCR技术检测整合子基因盒,应用PCR定位技术和DNA测序研究整合子插入耐药基因的情况。4)PCR产物的测序结果直接在GeneBank中(http://www.ncbi.nlm.nm.gov/BLAST/)进行序列比对分析。5)对相同长度片段的可变区扩增产物用DraI和EcoRV双酶切,确定是否携带相同的耐药基因盒。6)用A型超纯质粒提取及细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒从整合酶基因阳性菌株分别提取质粒和细菌基因组DNA,然后分别PCR,确定整合子的基因定位。7)利用PCR试验扩增孔蛋白基因OmpF,提取外膜蛋白,行SDS-PAGE电泳检测分析。8)采用微量稀释法测定22种抗生素对59株头孢西丁耐药的大肠埃希菌的最低抑菌浓度。结果1)59株耐头孢西丁的大肠埃希菌中有45株整合酶基因扩增阳性,经酶切和测序鉴定均为Ⅰ类整合酶基因。2)可变区扩增阳性产物,有6种不同长度片段,有36株出现1664bp条带,测序结果为含有2个开放阅读框,与耐药基因盒aadA5和dfr17 100%同源,分别对氨基糖苷类抗生素壮观霉素、链霉素和磺胺类药物甲氧氨苄嘧啶产生耐药,Genbank登陆号分别为AY748452,AY828551;2株出现1913bp条带,测序结果为整合子内部插入一个dhfrⅫ基因盒,编码二氢叶酸还原酶,对磺胺类耐药,和一个aadA2基因盒,编码氨基酰腺苷酰基转移酶,对氨基糖苷类耐药,还有一编码功能不清楚的ORF5,Genbank登陆号AY748453;2株出现2,360bp条带,测序结果为可变区共有2个耐药基因盒:包括一个aacA4,产生氨基糖甙乙酰转移酶AAC(6′)-Ib,对壮观霉素、链霉