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胰腺癌恶性程度极高,预后极差,消耗着巨大的社会卫生资源。目前对胰腺癌的传统治疗手段效果仍不尽如人意。探索新的有效治疗手段,提高胰腺癌的预后,是目前急需攻克的重要课题。MUC1是胰腺癌肿瘤相关抗原,可在胰腺癌表面异常表达,VNTR是MUC1最具免疫原性的结构,可诱发宿主产生MUC1特异、MHCⅠ限制的CTL,特异性地杀伤肿瘤细胞。本文以VNTR为靶抗原构建胰腺癌核酸疫苗,探索疫苗所诱生的免疫应答,以进一步研究疫苗对胰腺癌的治疗作用。实验共分为三部分:第一部分胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建和体外转染实验研究目的:以人胰腺癌肿瘤相关抗原MUC1的最具免疫原性的序列片段VNTR为靶抗原,将其编码基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(+) A质粒中,构建胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗。疫苗构建后进行体外转染试验,了解VNTR基因在哺乳动物细胞中的表达。材料和方法:首先对VNTR编码基因进行了重组设计,氨基端插入人单核细胞趋化蛋白Ⅰ信号肽基因序列,起始码前插入KOZAK促真核翻译序列。将人工合成的重组人VNTR基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(+) A质粒的EcoRI酶、HindⅢ酶之间,构建pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A重组质粒。自转化平板挑选克隆,EcoRI酶、HindⅢ酶双酶切鉴定后,挑选阳性克隆测序。通过测序鉴定的含有准确插入序列的pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A重组质粒转染COS7细胞,进行体外转染实验和Western blot检测VNTR在细胞内外的表达。结果:转化平板10个单克隆菌落,EcoRI酶、HindⅢ酶双酶切后, 7个克隆在100bp与250bp之间出现阳性片段。测序鉴定证实所构建的pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A重组质粒含有完整的阅读框架和rhVNTR基因。重组质粒可在COS7细胞内外表达VNTR,以胞内为主。所表达的VNTR分子量比人工合成的VNTR多肽大。结论:自行构建的胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗序列完全正确,可在哺乳动物细胞中表达VNTR。 <WP=5>第二部分胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗免疫正常小鼠的评价研究目的:以pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A重组质粒肌注免疫C57BL/6小鼠,研究疫苗是否也在体内表达VNTR,能否诱生MUC1特异性CTL应答为主的免疫应答。此外,本研究在进行免疫应答的评价时还包括了特异性抗体检测和细胞因子检测。材料和方法:C57BL/6(H-2b)正常小鼠,随机分3组:NS组(生理盐水)、D组(pcDNA3.1/Myc-his(+)A质粒)、V组(pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒)。小鼠麻醉后在右腿胫前肌中部注射100 μl 0.25%丁哌卡因,使局部肌肉坏死后再生。3天后在同一部位注射100μg/100μl质粒DNA生理盐水溶液。第1次免疫4周后,以同一质粒DNA再次免疫小鼠。2周后自内眦静脉内取血以ELISA法测抗VNTR抗体和细胞因子IFN-γ、TNF-α;取脾细胞悬液体外以VNTR合成肽特异性刺激培养,6-7天后进行以Calcein AM法进行CTL杀伤试验。结果:pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒免疫的小鼠脾细胞CTL的特异性杀伤率显著高于空质粒对照组(P<0.01)和生理盐水对照组(P<0.01)。表明pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒免疫的小鼠产生了显著的CTL应答,这一CTL应答是克隆于表达载体中的rhVNTR基因所诱生的。重组质粒诱生的特异性CTL对经VNTR合成肽孵育的靶细胞EL4-VNTR+杀伤作用明显,而对未经VNTR合成肽孵育的靶细胞EL4-VNTR-杀伤较低(P<0.01)。表明重组质粒诱生的CTL杀伤活性是VNTR特异性的。识别VNTR上的GVTSAPDTRPAP序列的单克隆抗体VU 3C6可抑制CTL杀伤活性(P<0.01),进一步表明CTL杀伤活性是VNTR特异性的。pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒免疫的小鼠血清抗VNTR抗体等效浓度(2323.5 ug/ml±238.3 ug/ml)高于空质粒对照组(1895.8 ug/ml±532.7 ug/ml)和生理盐水对照组(1736.4 ug/ml±141.9 ug/ml),差别极为显著(P<0.01)。表明pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A重组质粒中所插入的rhVNTR基因免疫小鼠后亦可诱发宿主产生抗VNTR的抗体应答。各组小鼠血清mIFN-γ、TNF-α浓度没有显著的变化。结论:自行构建的胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠后可诱生VNTR特异的CTL应答和抗体应答。<WP=6>第三部分HBcAg(1-144)基因、GM-CSF增强胰腺癌MUC1- VNTR核酸疫苗免疫效果的研究研究目的:抗原特异性免疫应答的诱生在很大程度上取决于机体对该抗原分子的处理和递呈的效率。在这个过程中,任何促进疫苗DNA的摄取、翻译和抗原的有效加工和提呈的分子疫苗设计和免疫策略都可能上调疫苗的免疫效果。为了进一步提高疫苗的免疫效果,在pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A质粒中插入了HBcAg(1-144)基因(C144基因),构建了pcDNA3.1-VNTR-C144/Myc-his(+) A质粒,进一步以GM-CSF为免疫佐剂,免疫C57BL/6小鼠,研究GM-CSF和C144基因在疫苗诱发免疫应答中的作用。材料和方法:以adr-hbv质粒为模板PCR获取C144基因,定向克隆入pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+) A质粒EcoR I酶和Xho I酶酶切位点之间,构建了pcDNA3.1-VNTR-C144/Myc-his(+) A质粒。通过测序和体外转染实验后,以50ng rmGM-CSF为免疫佐剂,免疫小鼠,研究所诱生的免疫应答。C57BL/6小鼠分6组:V 组(pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒)、VC组(pcDNA3.1-VNTR- C144/Myc-his(+)A质粒)、C 组(pcDNA3.1-C144/Myc-his(+)A质