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褐飞虱(Nilaparvata lugens St(a)l)是危害水稻的重要农业害虫之一，随季风迁移，极易爆发成灾。目前对于褐飞虱的防治主要依赖于化学防治，但是，长期、大量、不合理的化学杀虫剂使用，导致褐飞虱对很多常用杀虫剂产生了不同程度的抗药性，杀虫剂的防效降低，种群易发生再猖獗。目前，中国褐飞虱对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂以及苯基吡唑类杀虫剂（如氟虫腈）的抗性维持在中等抗性水平，对部分新烟碱类杀虫剂（如吡虫啉、噻虫嗪）均产生高水平抗性。 靶标不敏感是害虫产生抗药性的重要机理之一，基因突变导致杀虫剂的作用靶标发生了变异，这是害虫产生靶标抗性的重要机制。靶标抗性一旦形成，容易在害虫的种群中稳定存在，对害虫防治产生非常不利的影响。因此，对害虫靶标变异进行高效准确的检测，从而对害虫的靶标变异发生程度进行评估，对于害虫防治意义重大。 乙酰胆碱酯酶(AChE)是有机磷和氨基甲酸酯类（如毒死蜱、辛硫磷、叶蝉散）杀虫剂的作用靶标，γ-氨基丁酸受体(GABAR)是苯基吡唑类杀虫剂（如氟虫腈、乙虫腈、丁烯氟虫腈）的作用靶标。前期研究发现，褐飞虱中AChE和GABAR这两个靶标发生变异，致使褐飞虱对有机磷和氨基甲酸酯类以及苯基吡唑类杀虫剂的敏感性下降。本文基于分子生物学技术，建立了用于快速检测褐飞虱AChE和GABAR与抗药性相关的靶标变异的双向特异等住基因PCR检测方法(Bidirectional PCR Amplification of Specific Alleles，Bi-PASA)和环介导等温扩增检测方法(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)。 一、利用Bi-PASA方法检测褐飞虱AChE上的G119S突变 目前，在褐飞虱和其他几个种类害虫AChE(AChE1)中鉴定了突变G119S，119住点位于其活性位点峡谷底部的氧阴离子洞上，甘氨酸(Gly)被丝氨酸(Ser)取代会导致空间位移，增强有机磷和氨基甲酸酯分子的周转或阻断酶与杀虫剂的初始反应。本实验室前期研究中发现，褐飞虱AChE1的G119S突变导致其对毒死蜱的敏感性下降。 本研究以Bi-PASA技术为基础，设计两对特异性引物，建立一种检测褐飞虱G119S突变的方法，并且可以鉴定出抗性基因型。以待测个体的基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物进行电泳检测，电泳结果如果有三条带，则说明个体为抗性杂合子，如果是上方两条带，则个体为抗性纯合子，如果一大一小两条带则说明个体为敏感纯合子。该方法稳定性强、准确性高。 二、利用LAMP方法检测褐飞虱AChE上的G119S突变 LAMP技术相比于Bi-PASA技术具有简单、快速、高效、低成本的特点。LAMP反应在恒定温度下即可发生，不需要PCR仪，并且反应结束后不需要电泳检测，可通过添加染色剂直接观察反应结果。 本章以LAMP技术为基础，建立了快速检测褐飞虱G119S突变的方法。通过对多组引物的筛选，得到一组特异性引物;对LAMP反应体系及条件进行优化得到最优的反应体系及条件。本章建立的LAMP检测体系为:2.5μL10×Isothermal Amplification Buffer，8U Bst2.0DNA polymerase，1μL待测个体褐飞虱基因组DNA，终浓度0.25mmol/L dNTPs、1mmol/L MgSO4、0.2μmol/L F3/B3、0.8μmol/L FIP/BIP、0.4mol/L的甜菜碱，200mmol/L羟基萘酚蓝(HNB)加双蒸水至反应总体积为25μL。本方法以羟基萘酚蓝(HNB)为指示剂，在64℃恒温条件下反应60-70min，通过对比反应前后颜色的变化，可得出检测结果。反应结束后，反应液仍为紫色，则说明个体为敏感型个体;若反应液由紫色变为天蓝色，则个体为抗性个体。 三、利用LAMP方法检测祸飞虱GABA受体的A302S突变 昆虫γ-氨基丁酸受体是苯基吡唑类杀虫剂的重要靶标，其中的RDL亚基能形成功能性的GABA门控阴离子通道，RDL亚基的第二跨膜区的第302位丙氨酸被丝氨酸取代(A302S)，导致抗药性产生。目前已确定褐飞虱RDL中存在A302S突变，并且与氟虫腈抗性密切相关。本章以LAMP技术为基础，成功设计并筛选出一组引物对褐飞虱RDL的A302S突变进行检测。本章建立的LAMP检测体系为:2.5μL10×Isothermal Amplification Buffer，6U Bst2.0DNA polymerase，1μL待测个体褐飞虱基因组DNA，终浓度0.25mmol/L dNTPs、1mmol/L MgSO4、0.2μmol/L F3/B3、1.2μmol/L FIP/BIP、0.6mol/L的甜菜碱，200mmol/L羟基萘酚蓝(HNB)加双蒸水至反应总体积为25μL，64℃,70min。该种检测方法一个反应只需一个小时左右，操作简单，反应结束后即可得到检测结果。