论文部分内容阅读
目的:研究优化大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs),即提纯其中的多系分化持续应激(Muse)细胞和用血红素加氧酶-1(HO-1)进行修饰,对受损的肠上皮细胞(IECs)的保护效果,并对其分子机制进行深入研究。方法:1.贴壁筛选法提取大鼠BMMSCs,并通过流式细胞术等实验技术进行表型、纯度及功能鉴定;2.胰酶持续孵育法提纯大鼠BMMSCs中的Muse细胞,并进行多能分化和定向诱导分化鉴定;3.使用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)构建体外IECs炎性损伤模型,Transwell隔离状态将Muse细胞与炎性损伤IECs共培养,Cell Counting Kit-8(CCK-8)与Ed U细胞增殖等实验检测Muse细胞对炎症损伤IECs模式细胞的保护作用,并使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测微环境内炎性相关细胞因子表达水平;4.腺病毒转染法获得HO-1基因修饰的BMMSCs(HO-1/BMMSCs);5.Transwell隔离状态将HO-1/BMMSCs与炎性损伤IECs共培养,采用CCK-8、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡与原位Td T介导的d UTP缺口末端标记(Tunel)实验技术,检测HO-1/BMMSCs对炎症损伤IECs细胞凋亡的作用,同时用苏木素-伊红染色及免疫损伤评分与Tuenl实验评价其对大鼠小肠移植(SBTx)排斥反应模型的移植小肠的影响;6.分离HO-1/BMMSCs共培养体系中的外泌体(HBM-exo)进行透射电镜和纳米颗粒跟踪分析(NTA)等鉴定,用HBM-exo刺激炎性损伤的IECs,以检测其对炎性损伤IECs的保护作用,采用质谱法检测IECs中的蛋白表达谱的改变,并筛选关键蛋白;7.采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和双荧光素酶报告等分子生物学技术,明确HBM-exo中的关键Micro RNA及其靶分子在HO-1/BMMSCs保护炎性损伤IECs作用中的机制,并在SBTx模型中进行初步验证。结果:1.实验相关的细胞的提取、培养和验证:(1)从细胞表型、成脂及成骨定向分化等方面检测,提示:提取的大鼠BMMSCs符合国际的标准要求;(2)分离纯化细胞阳性细胞,表达阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)及其他多能分化标记,并且能够诱导分化为三个胚层的细胞,符合Muse细胞的要求;(3)通过蛋白和RNA水平检测验证了HO-1/BMMSCs构建成功;(4)形态学及NTA等证实提取到的外泌体符合标准。2.从BMMSCs中分离纯化出的大鼠Muse细胞,作用到炎性损伤肠上皮模式细胞,从细胞活性及紧密连接蛋白表达水平等方面,证实其具有更理想的保护炎性损伤IECs模式细胞的作用,其机制与Muse细胞更强的耐受炎症刺激的能力及减轻炎性微环境有关。3.HO-1基因修饰优化的BMMSCs,能够显著减轻IECs的炎性损伤及SBTx大鼠的肠道损伤,表现在减少IECs的凋亡,保护IECs间的紧密连接结构等超微结构;提示其旁分泌功能发挥重要作用。4.HBM-exo具有理想的减轻IECs炎性损伤,表现为保护IECs的细胞活力,减少IECs的细胞凋亡与保护细胞间紧密连接蛋白(ZO-1)的作用。5.质谱检测表明,HBM-exo显著下调炎性损伤IECs中的高迁移率族蛋白B3(HMGB3)蛋白及c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的表达,而且HMGB3/JNK参与了IECs的炎性损伤过程。6.HBM-exo及其刺激的IECs中,Micro RNA(Mi R)-200b水平显著升高,同时进一步实验表明Mi R-200b靶向结合HMGB3的3’-非翻译区,从而调控HMGB3的表达。7.Mi R-200b能够减少Caspase-3蛋白的剪切比例,保护ZO-1蛋白的水平,并减少细胞凋亡,减轻IECs的炎性损伤,而干扰Mi R-200b可以阻断HBM-exo对炎性损伤IECs的保护作用。结论:从BMMSCs中提取Muse细胞和进行HO-1基因修饰的BMMSCs均是有效的优化方案,对炎性损伤的IECs均具有更加理想的保护作用。其机制与优化的BMMSCs分泌的外泌体发挥重要的作用有关。其中外泌体Mi R-200b靶向调控HMGB3能调控JNK通路发挥重要的信息传递作用。