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香菇C91-3菌株是本课题组经过多年筛选获得的一株具有较强应用价值的真菌。香菇C91-3菌株菌丝体发酵液具有较好的诱导肿瘤细胞凋亡的作用已经被本课题组所证实。在此基础上，通过生物信息学分析，初步筛选出一些与细胞凋亡相关的目的基因，并对其进行命名。再通过cDNA末端的快速扩增(Rapid Amplification ofcDNA ends，RACE)方法和生物信息学比对，获得基因全长及相应的氨基酸序列。本实验的研究对象是香菇C91-3菌株Latcripin-9基因。 目的:利用生物信息学方法寻找并确定Latcripin-9的基因序列、功能域片段及相应的氨基酸序列。对Latcripin-9蛋白的二级结构、三级结构进行分析预测，全面获取Latcripin-9基因的详细信息。构建原核表达载体pET32a(+)-Latcripin-9，IPTG诱导使Latcripin-9蛋白在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中表达，并对诱导表达产物进行鉴定。通过生物信息学软件分析，预测出Latcripin-9蛋白的生物学活性及相应功能。采用不同方法检测Latcripin-9蛋白的体外抗氧化活性，并进一步将香菇C91-3菌株重组蛋白Latcripin-9作用于不同的肿瘤细胞，对Latcripin-9蛋白在体外抗肿瘤方面的效果进行初步研究，本实验将为深入研究Latcripin-9蛋白的生物学功能及发掘其应用潜力奠定良好的物质基础和理论依据。 方法:①从香菇C91-3菌株中提取其总RNA，通过反转录获得cDNA文库，根据反转录的结果，利用高通量测序获得转录组mRNA，通过生物信息学比对，获得目的序列。利用3-Full RACE、5-Full RACE方法获得目的基因Latcripin-9的基因全长。经NCBI、Pfam等数据库在线比对分析得到Latcripin-9功能域序列，进一步通过生物信息学技术分析获得Latcripin-9功能域序列的氨基酸组成、预测其理化性质及生物学活性。②将Latcripin-9的功能域序列克隆到原核表达载体pET32a(+)中，构建重组表达质粒pET32a(+)-Latcripin-9，将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中，对其进行诱导表达，利用SDS-PAGE及WesternBlotting方法鉴定表达产物。采用镍柱亲和层析的方法对重组Latcripin-9蛋白进行分离纯化，并通过尿素梯度透析复性纯化后的目的蛋白，BCA法测定复性后的蛋白浓度。③圆二色光谱法测定复性后的Latcripin-9蛋白的二级结构。④Latcripin-9蛋白的抗氧化活性测定:分别采用DPPH(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)法、FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power)法、ABTS(2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))法等3种方法测定Latcripin-9蛋白的抗氧化活性;⑤Latcripin-9蛋白的抗肿瘤活性研究:将Latcripin-9蛋白作用于人肺癌细胞A549，采用四氮唑蓝比色分析法(Methyl Thiazoly LtetraZolium，MTT)法测定Latcripin-9蛋白对肿瘤细胞A549生长的抑制效果;同时用MTT法检测Latcripin-9蛋白对鸡胚成纤维细胞、Vero细胞生长的影响;采用透射电镜法观察Latcripin-9蛋白作于人喉癌Hep-2细胞及人肺癌A549细胞后，细胞相应的形态学变化;用采用流式细胞术检测Latcripin-9蛋白作用于A549细胞后，细胞的凋亡情况。 结果:①采用RACE方法获得Latcripin-9基因全长，通过PCR扩增获得功能域序列。对Latcripin-9功能域序列分析，发现其为染料脱色过氧化物酶结构(DyP_Perox)。②利用EcoRI和Xho I两种限制性内切酶，通过双酶切的方法确定在原核表达载体pET32a(+)中成功插入Latcripin-9功能域基因序列。利用SDS-PAGE及Western Blotting方法验证Latcripin-9蛋白表达成功。所得蛋白经镍柱亲和层析法纯化获得单一目的蛋白。采用BCA方法测定目的蛋白的浓度，得到标准直线方程y=0.0462x+0.0108，R2=0.9986。通过方程计算获得蛋白浓度:1.671mg/mL。③3种国内外常用的体外抗氧化活性能力检测法(DPPH法、FRAP法、ABTS法)结果显示，目的蛋白Latcripin-9具有明显的抗氧化能力，且抗氧化能力随着浓度的增加而增强，但与维生素C(VC)相比，弱于VC。④MTT结果表明，Latcripin-9蛋白对鸡胚成纤维细胞及Vero细胞无毒性作用，对人肺癌细胞A549的生长具有明显的抑制作用，且具有一定的时间和浓度依赖性，当蛋白浓度为100μg/mL，作用12h时，抑制率达到最大(约为30％)，与对照组比有显著差异。电镜结果可知，Latcripin-9蛋白能够引起人肺癌细胞A549出现自噬，诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡。流式细胞术检测结果表明目的蛋白对人肺癌细胞A549有杀伤作用，能够引起细胞出现凋亡现象。 结论:①通过对香菇C91-3菌株的转录组序列进行相关生物信息学分析，成功筛选出具有过氧化物酶活性的Latcripin-9基因，并通过RACE方法得到相应的基因序列全长。②采用基因重组技术成功构建重组质粒pET32a(+)-Latcripin-9，采用热转化法转化该质粒到大肠杆菌表达宿主E.coli Rosetta-gami(DE3)中，使重组Latcripin-9蛋白得到了成功表达。亲和层析法成功对Latcripin-9蛋白进行纯化，尿素梯度透析法成功复性Latcripin-9蛋白。③体外抗氧化活性研究表明，Latcripin-9蛋白具有抗氧化活性，为进一步研究其在抗氧化方面的应用奠定基础。④MTT法初步证明Latcripin-9蛋白对正常鸡胚成纤维细胞、Vero细胞无毒性作用，对人肺癌细胞A549的生长具有明显的抑制作用，初步研究表明Latcripin-9蛋白对Hep-2细胞、A549细胞生长均具有一定的抑制作用，为进一步研究其抗肿瘤方面的具体作用机制奠定基础。