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1目的Mincle是巨噬细胞表达感知组织损伤引发炎症的受体,研究该蛋白有助于寻找治疗自体免疫性疾病的新途径。威灵仙为为毛茛科铁线莲属植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck.、棉团铁线莲C. hexapetala Pall.和东北铁线莲C. mandshurica Rupr.的干燥根及根茎,具有祛风除湿、通络止痛的功效,为治风湿痹痛之要药,现代药理表明其具有显著抗炎活性。本研究拟对威灵仙进行质量检查、定性和定量分析,为有效控制威灵仙质量提供依据；并利用现代基因工程技术对Mincle基因进行克隆,通过大肠杆菌进行诱导表达蛋白,为考察威灵仙与Mincle蛋白的相互作用,从中药中寻找和筛选抗炎药物提供理论与实践基础。2方法2.1威灵仙质量分析参照《中国药典》2010年版,对威灵仙药材进行定性和定量分析。采用薄层鉴别对威灵仙酸水解成分进行鉴别；采用RP-HPLC法测定齐墩果酸、常春藤皂苷元的含量；并采用HPLC法建立威灵仙药材的指纹图谱。2.2利用基因工程技术原核表达Mincle蛋白克隆目的基因：提取经LPS活化的小鼠巨噬细胞的总RNA并反转录,根据GenBank公布的Mincle mRNA序列,设计特异性PCR引物进行PCR扩增,得到Mincle-1和Mincle-2目的基因。构建克隆质粒：PCR产物经回收纯化后连接pMD18-T,转化E.coli DH5a感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性重组子,并通过酶切鉴定、序列比对等方法验证。构建原核表达质粒：用相应引物对携带Mincle-2的克隆质粒进行PCR扩增并进行双酶切处理,回收纯化后连接原核表达载体pET-14b和pET-16b,转化E.coli DH5a感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性重组子,并通过酶切鉴定、序列比对等方法验证。表达与纯化融合蛋白：将携带Mincle-2的原核表达质粒转化E.coli BL21,通过氨苄青霉素抗性筛选以及酶切验证获得阳性菌落；接种单菌落,用IPTG诱导表达,纯化融合蛋白后,利用SDS-PAGE对融合蛋白进行分析鉴定。3结果3.1威灵仙质量分析建立了薄层鉴别的方法,薄层色谱斑点清晰、分离度好。建立了齐墩果酸、常春藤皂苷元的含量测定方法,来自两广的粉灵仙常春藤皂苷元和齐墩果酸的含量均大于0.30%,达到《中国药典》2010年版规定的限度,10批威灵仙的常春藤皂苷元含量在0.008%-0.193%之间,均不符合《中国药典》2010年版规定0.3%的限度。分别构建了来自两广的粉灵仙药材和威灵仙的指纹图谱,其中粉灵仙HPLC指纹图谱标定了13个共有峰,各批次样品平均相似度大于0.817；粉灵仙指纹图谱与威灵仙图谱进行了对比,两者之间相似度较低。3.2Mincle蛋白表达目的基因扩增：PCR产物大小与预期一致,可初步判断目的基因Mincle-1、 Mincle-2扩增成功。构建克隆质粒：单、双酶切,琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明,成功构建了携带Mincle-1和Mincle-2的克隆质粒pMDl8T-Mincle-1、pMD18T-Mincle-2。构建原核表达质粒：酶切验证和序列比对结果表明,成功构建了携带Mincle-1和Mincle-2的原核表达质粒pET14b-Mincle-2、pET16b-Mincle-2,相应的N-末端含His6标签融合蛋白的理论分子量为22kDa。表达与纯化融合蛋白：SDS-PAGE分析结果表明携带pET16b-Mincle-2和pET14b-Mincle-2的大肠杆菌E.coli BL21经IPTG诱导表达后,均有表达预期大小(22kDa)的融合蛋白,并以包涵体的形式存在。包涵体经变性后纯化得到的融合蛋白产物表观分子量为22kDa,与预期融合蛋白大小吻合。4结论4.1威灵仙质量分析建立威灵仙薄层鉴定、含量测定方法及指纹图谱方法,方法稳定可靠,可为威灵仙药材内在质量控制提供科学依据。薄层鉴定和含量测定结果提示来自两广地区的粉灵仙指标性成分含量较其他商品威灵仙高；粉灵仙及威灵仙的指纹图谱提示粉灵仙中大极性物质含量较高；为后续试验选取优良的药材提供理论基础。4.2Mincle蛋白表达成功克隆鼠源Mincle基因,构建克隆质粒和原核表达质粒,并进行诱导表达及蛋白纯化,得到的融合蛋白为包涵体,变性后纯化得到的融合蛋白产物大小与预期吻合,为Mincle蛋白与威灵仙主要成分相互作用研究打下坚实的基础。