引言： 原发性肝癌，是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居癌症死亡率第二位，且近年来有上升趋势。由于肝癌细胞对放疗的不敏感性，手术和化疗是目前医学界最主要的治疗方式。而相当大部分的肝癌患者已处于中晚期，丧失了最佳手术机会。 许多化疗抗癌药物，往往因其靶向性差、半衰期短、毒副反应大而疗效欠佳。抗癌药物靶向性差，以致其在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常细胞如造血细胞、消化道黏膜细胞等也有很大的损害，造成骨髓抑制等严重的毒副反应，使相当一部分患者因难以承受而拒绝或放弃治疗。传统化疗药物半衰期短，致使化疗药物无法在肿瘤病灶内较高且有效的聚集。因此，如何既高效、特异的杀伤肿瘤细胞，又最少程度的损害正常细胞组织一直受到医学界的高度重视。长期以来，医学界一直希望通过肿瘤细胞与正常细胞蛋白表达差异，从而有效识别区分肿瘤细胞及正常细胞，而大量文献表明，叶酸受体在上皮细胞来源肿瘤呈过表达状态，而正常组织细胞表达较少，由于叶酸本身的无免疫原性，高生物相容性，结构稳定及造价成本低廉等优点，使其成为肿瘤治疗的理想靶点。 纳米生物技术是指用于研究生命现象的纳米技术，在医学中有着广泛的应用前景，目前主要集中在纳米载体、纳米药物等方面。纳米载体是指利用天然高分子或合成的化合物质为载体制成固态高分子载药微粒，直径10～1000nm之间，药物或MRI对比剂等物质可包埋或溶解在纳米粒子的内部，也可吸附或耦合在其表面。纳米药物具有很多优点，如可靶向给药、半衰期长、稳定性好、毒副作用小等，主要应用于抗肿瘤等药物的靶向给药。 纳米胶束是一种多功能复合纳米粒子，它是利用两亲嵌段共聚物与自组装技术制备而成，具有表面亲水、内部疏水的独特壳—核结构，其亲水性的外壳使胶束能够高度分散于机体水溶性内环境并随血液循环传输到特定部位，而其疏水性内核则可以充当疏水性药物控制释放的“纳米药库”。通过聚合物两亲比例的控制，纳米胶束可控制在10～200nm范围内，高分子药物可通过疏水作用而方便的包埋入胶束的内核，这些特点使其类似于一些天然的高效生物传输系统如脂蛋白和病毒等。纳米胶束可通过静脉注射参与血液循环，穿过粘膜组织，其合适的纳米尺寸(10～200nm)，有利于减少肾脏的排泄清除、网状内皮系统吸收和吞噬细胞的识别，从而延长在体内的循环时间，提高半衰期。由于肿瘤组织自身的特征，如血管网丰富、血管内皮疏松、淋巴管缺乏等，使得纳米粒子容易从血管中进入肿瘤组织而不易被淋巴管吸收返回至血液循环，通过这种增强的渗透及保留作用，聚合物胶束在肿瘤局部获得了独特的被动靶向聚集功能。另外，纳米胶束通过被动靶向运输及控制释放，可减少药物与正常组织或细胞接触，从而减少毒副作用。所以，利用纳米胶束进行抗癌药物的传输已经成为一个热门的研究领域。 研究目的： 本研究通过制备外部能耦连叶酸且内部能高效负载抗肿瘤药物的两亲聚合物纳米胶束载体PEG—PDLLA，通过体外实验初步探讨其表征、控释性能、靶向吸收效率及细胞毒性四方面的特性，探讨PEG—PDLLA纳米胶束作为药物靶向输送载体对肝细胞癌的靶向化疗作用，探索一种靶向性高、控释性强、毒副作用小的药物传输系统，从而为肝癌的靶向化疗提供新的途径和模式。 研究方法： (1)纳米胶束表征通过多步骤化学反应及自组装技术合成两亲聚合物纳米胶束FOLATE—PEG—PDLLA—DOX，通过紫外分光光度仪检测器检测其药物负载量；通过动态光散射分析其胶束粒径。 (2)体外释放实验 将胶束溶解入一定透析分子量的透析袋中，两端扎紧封闭，放入装有一定体积ph值PBS缓冲液的烧杯中．然后将烧杯放入落地式恒温振荡器中，通过模仿人体内环境条件，在37±0.5℃每分钟恒温振药75次．每隔一定的时间间隔取出透析袋外析出的DOX溶液，并准确加等量PBS溶液．利用分光光度计测定DOX吸收度，利用标准曲线方程折算出药物浓度。释药结束后，收集透析带中残留胶束，测定残留药量验证其释药效果。以累计释放药量对时间作图，绘制药物在两种PH下释放曲线图． (3)靶向吸收的体外实验研究 取对数生长期的Bel7402肝癌细胞株，分四组： A组为靶向组，加入FOLATE—PEG—PDLLA—DOX；B组为非靶向组，加入PEG—PDLLA—DOX；C组为竞争抑制组，加入游离叶酸及FOLATE—PEG—PDLLA—DOX；D组为对照组，仅加入PBS溶液。共孵育后利用DOX本身具有的荧光性质，在荧光倒置显微镜下观察并摄片。其中C组通过体外竞争抑制实验，核实叶酸在靶向肿瘤细胞的作用． 步骤同前，用0.25％胰酶消化，用流式细胞仪检测样品。检测各组的平均荧光强度及荧光阳性细胞百分比，进一步检测其各组纳米胶束的吸收效率。 (4)细胞毒性研究 取对数生长期的Bel7402肝癌细胞株，分四组： A组靶向组(加入FOLATE—PEG—PDLLA—DOX)，B组非靶向组(加入PEG—PDLLA—DOX)，C组胶束组(FOLATE—PEG—PDLLA+FREE DOX)，D组DOX组(加入游离DOX)。用MTT实验，在微孔板酶标仪于490 nm波长处测吸收光度，计算杀伤率：杀伤率=(1-实验孔A490/对照孔A490)×100％，以spss11.0统计软件计算IC50。A组与B组比较探测靶向组与非靶向组细胞杀伤区别，C组与D组比较探测空白胶束毒性试验，A组与D组比较探测游离药物与负载药物的靶向纳米细胞杀伤差别。 结果： 1、表征：通过多步骤化学反应及自组装技术成功合成FOLATE—PEG—PELLA—DOX，其胶束粒径60.6±1.8nm，载药量4.8±0.2％，包封率24.0±1.2％。 2、体外释放实验： FOLATE—PEG—PDLLA—DOX中DOX释放具备明显的缓释性能，其释放时间超过40天，其40天时释放约75.24％；其释放曲线包括两个释放期相，前6天呈明显快速释放，随后进入持续缓慢释放期；在两种不同ph值的释放曲线中，胶束在ph=5.0 PBS缓冲液中释放速度明显超过在ph=7.4 PBS缓冲液． 3、靶向吸收效率研究： (1)平均荧光强度：靶向组16.38±0.4146；非靶向组8.04±0.3989；竞争抑制组9.636±0.2505。有叶酸耦联的靶向组荧光强度明显较无叶酸胶束的非靶向组增高，说明有叶酸耦联的胶束更多量的进入了细胞，通过LSD—单因素方差分析，靶向组荧光强度高于非靶向组，二者具有统计学差异(p<0.05)；靶向组亦明显高于竞争抑制组，二者具有统计学差异(p<0.05)。 (2)荧光细胞百分比：靶向组为0.9959±0.0026；非靶向组为0.4434±0.0085；竞争抑制组为0.6176±0.0278。通过基于秩次的非参数检验，靶向组高于非靶向组，p<0.05；靶向组亦高于竞争抑制组，p<0.05)。 4、细胞毒性研究： 靶向组细胞抑制率明显高于非靶向组，二者具有统计学差异(p<0.05)，说明耦连叶酸的靶向制剂可有效促进了吸收效率；DOX组与胶束组细胞抑制率相当，二者无统计学差异(p>0.05)，说明空白胶束无细胞毒性。 结论： 1、通过多步骤化学反应及自组装技术可成功合成纳米胶束FOLATE—PEG—PDLLA—DOX，其粒径仅约60nm，载药率及包封率较高。 2、叶酸受体介导的纳米胶束FOLATE—PEG—PDLLA—DOX中DOX释放行为具有明显的控释性；并且具有PH值敏感性，在ph5.0的酸性环境中DOX释放明显较ph7.4的环境中增快，提示在人体内靶向吸收到细胞内的胶束DOX释放较细胞外释放增快。 3、FOLATE—PEG—PDLLA—DOX具备明显的肝癌细胞靶向作用，吸收效率较无耦连叶酸的非靶向PEG—PDLLA—DOX明显增高；竞争抑制实验证实叶酸受体为肝癌细胞的理想靶点。 4、两亲聚合物纳米胶束本身无细胞毒性。具有酸受体靶向的纳米粒子FOLATE—PEG—PDLLA—DOX较无叶酸受体靶向功能的纳米粒子PEG—PDLLA—DOX有更高的肿瘤抑制效率。