限制性内切酶BstEⅡ（G/GTNACC）是生命科学基础研究的重要工具酶,其研究通常聚焦于酶的发现、分类和识别序列鉴定,而对限制性内切酶的结构、理化性质和工程改造研究尚不完善。BstEⅡ的多位点识别能力赋予其较大的改造潜力。为了探索BstEⅡ的结构与理化性质,拓展BstEⅡ在生物技术领域的应用,本研究采用生物信息学技术进行分析了BstEⅡ的化学性质、二级结构,并以穿线法预测其三级结构。利用凝胶过滤层析、多角度静态光散射、圆二色谱、荧光偏振等方法表征了BstEⅡ的理化性质。最后,在不同二价金属离子、不同pH、不同盐浓度下检测了BstEⅡ的星号活性。主要研究结果如下:（1）采用生物信息学技术预测BstEⅡ的化学性质、有序性、二级结构和三级结构。结果认为第244位氨基酸D为BstEⅡ的关键氨基酸,并在后续经实验验证,将244位的D突变为Y后,酶失去切割双链的能力。（2）合成了密码子优化的BstEⅡ基因及BstEⅡ D244Y突变体基因（将244位的氨基酸D突变为Y）,在18℃、0.3 mM IPTG诱导下得到大量表达的蛋白,经过镍柱亲和层析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析纯化,获得了高纯度、高浓度的大量BstEⅡ及BstEⅡ D244Y（D244Y）蛋白。（3）多角度静态光散射验证了BstEⅡ在溶液中以二聚体形式存在;圆二色谱表明了BstEⅡ相较于D244Yα-螺旋含量更高,β-折叠含量较低,反平行β-折叠增加;单波长变温分析表明BstEⅡ的变性温度为72.95℃;荧光偏振表明了BstEⅡ在最适结合条件（pH 5.0 20 mM NaCl）与GGTGACC结合效率最高,而D244Y在该条件下,与GGTAACC结合效率最高。表明BstEⅡ在第244位的D突变成Y以后,结构发生了变化,导致酶的识别位点发生改变,不在切割原来的识别位点。（4）限制性内切酶特异性的改变可能会导致宿主细菌的死亡。在改造限制性内切酶之前需要将其酶活位点突变掉,然后再改造其特异性可以有效防止其特异性的改变导致宿主细菌的死亡,在筛选到新的特异性后将其酶活位点突变回来既可以得到新的限制性内切酶。D244Y丧失了切割双链DNA的活性,可以作为后续定向进化研究的材料。并检测在不同二价金属离子、不同pH、不同盐浓度下BstEⅡ的星号活性。综上所述,本研究成功构建了BstEⅡ基因及BstEⅡ D244Y突变体在大肠杆菌中的高效表达系统,初步解析了BstEⅡ蛋白的聚集形式、最适酶切条件及与BstEⅡ和D244Y结合DNA最适的条件与识别序列。本研究将为BstEⅡ蛋白三维结构的解析、功能研究和BstEⅡ蛋白的定向改造奠定坚实的研究基础。