扁蓿豆低温胁迫转录组测序及MrLEA2的克隆和原核表达

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低温是一个非常重要的环境因素,广泛的影响着植物的生长、发育以及生物产量,在青藏高原上低温的影响尤为明显。扁蓿豆较强的抗寒性,是能够在青藏高原成功越冬的唯一野生苜蓿属豆科牧草,对它的抗寒性研究具有重要的意义。  本文分别对低温处理0小时,8小时,14天的扁蓿豆幼苗通过Illumina测序技术进行了转录组测序,获得的原始读序分别为58,590,262、60,267,412和62,559,586个,通过Trinity组装出Contig分别为106,077、105,274和120,547个contig片段,最终分别拼接形成了64,807、64,122和75,830条Unigene;通过与Nr、Nt、SwissProt、KEGG、COG和GO数据库的比对,共67,010个Unigenes基因得到注释。注释到Nr数据库的有56,023个基因,注释到SwissProt数据库的有33,191个基因,注释到KEGG数据库的有30,167个基因,注释到COG的有19,670个基因,注释到GO的有44,461个基因;每两个表达谱数据库获得的基因数据进行合并整理以及比较后,进行差异显著性分析。在低温处理0小时跟处理8小时的基因表达差异比较中,发现有4,749个基因出现上调,同时还有7,146个基因出现下调;在0小时和14天的比较中有8,009个基因上调和5,993基因下调的现象;在8小时和14天的对比中上调基因有8,040个基因上调,伴随3,955个基因下调,它们可能在植物的抗胁迫过程中起到重要的作用。  根据转录组测序结果,从扁蓿豆(Medicago ruthenica L.)幼苗中克隆到一个编码晚期胚胎发生丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein)的基因MrLEA2,Pfam数据库检索表明其编码产物属于LEA2蛋白家族。半定量RT-PCR分析发现MrLEA2在幼苗中表达水平不受非生物胁迫(脱水、高盐和低温)和脱落酸诱导。利用MrLEA2基因构建原核表达载体,在大肠杆菌中实现了过量表达。通过斑点试验(spot assay)和菌落计数实验,对过量表达MrLEA2蛋白的大肠杆菌细胞在高盐(0.5mol/L NaCl和0.5mol/L KCl)、55℃高温和-20℃冷冻胁迫处理下的生长存活情况进行了检测,发现MrLEA2蛋白过量表达能够明显提高大肠杆菌对上述胁迫的耐受性,上述结果表明MrLEA2蛋白对高盐和温度胁迫引起的细胞损伤具有保护作用。
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