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人参皂苷是人参的主要活性成分,目前已分离纯化出150多种。不同的皂苷在人参中的含量不同,如Rg3、Rh2、CK、F1、F2和Rh1等含量较低,被称为稀有皂苷。有些稀有皂苷往往具有较好的药理学活性。稀有皂苷与同类高含量皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1等）相比,皂苷元结构相同,只是糖基数目不同。因此,可通过水解高含量皂苷的糖基来制备稀有皂苷。目前,水解人参皂苷糖基的方法主要有加热裂解、酸碱催化、生物转化等。糖苷酶由于具有温和性、高效性、特异性等优点,成为制备稀有人参皂苷的有效工具。寻找多种专一性好、活性高的糖苷酶,为制备稀有人参皂苷带来便利,具有重要的理论意义和应用价值。目前,仍缺乏对糖苷酶底物选择性的系统了解,需要解析多种糖苷酶的三维结构去进一步分析。分析糖苷酶的结构,对改造酶分子也具有重要的指导意义。本论文主要研究成果如下:1.六种糖苷酶的制备与性质研究在E.coli BL21（DE3）中成功表达出六种糖苷酶CcBgl2、CcBgl3、CcBgl5、CcBgl6、CcBgl7和BglPC28。生化性质研究结果表明,在pH 6.0-7.0、30 oC条件下六种糖苷酶均具有较高的活性和良好的稳定性,Cu2+、Hg2+和SDS对其活力具有明显的抑制作用。其中,CcBgl5和CcBgl7具有较高的催化效率(kcat/Km),分别为57.16±3.37 mM-1 s-1和17.52±1.80 mM-1 s-1。底物专一性研究结果显示,CcBgl2和CcBgl3主要具有β-1,2/1,3/1,4葡萄糖苷酶活性;CcBgl5主要具有β-1,2/1,3葡萄糖苷酶活性;CcBgl6主要具有β-木糖苷酶活性;CcBgl7主要具有β-1,6/1,3/1,2葡萄糖苷酶活性。CcBgl5、CcBgl7和BglPC28分别能够特异性水解人参皂苷C-3位外侧葡萄糖、C-20位外侧葡萄糖和内侧葡萄糖,可应用于稀有人参皂苷的制备。2.组合酶法制备系列稀有人参皂苷以高含量人参皂苷Rb1为底物,通过组合糖苷酶CcBgl5、CcBgl7和BglPC28可实现系列稀有人参皂苷的制备。CcBgl5可将Rb1转化成Gyp XVII;CcBgl5和CcBgl7可将Rb1转化成F2;CcBgl7和BglPC28可将Rb1转化成Rg3,加入CcBgl5继续转化,产物为Rh2;CcBgl5和BglPC28可将Rb1转化成Gyp LXXV,加入CcBgl7继续转化,产物为CK。进一步确定了制备稀有人参皂苷单体的最佳条件,利用适当的缓冲液（pH6.0-7.0）,温和条件下（30 oC）,2-12 h完成底物转化。转化产物Gyp XVII、F2、Rg3、Rh2、Gyp LXXV和CK经过纯化后,纯度可分别达到90.5%、92.7%、95.8%、93.1%、91.3%和91.5%,产率分别为77.6%、73.4%、79.9%、78.3%、76.5%和75.3%。3.三种糖苷酶晶体结构的解析本论文对三种糖苷酶进行了结构解析,最终获得了CcBgl7晶体结构、CcBgl7与甘油共晶体结构、CcBgl7与龙胆二糖共晶体结构、CcBgl7与Rb1中龙胆二糖部分的共晶体结构、CcBgl7与Rb1共晶体结构和BglPC28与甘油共晶体结构,分辨率分别达到2.02?、2.40?、2.40?、2.50?、2.40?和2.50?。CcBgl7由（α/β）8桶状结构域、（α/β）6三明治状结构域和纤维连接蛋白III型结构域组成。CcBgl7与底物共晶体结构显示,位于-1亚位点的氨基酸残基（Asp83、Arg146、Lys185、His186和Asp264）在捕获和稳定非还原端葡萄糖时起到重要作用。同时,在CcBgl7的催化中心观察到酶-底物中间体,该中间体由非还原端葡萄糖吡喃环上的氧和异头碳形成的含氧碳正离子与Asp264通过共价键形成。