【摘 要】
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第一部分 MI)R1、GSTⅡ特异性siRNA真核表达载体的构建 目的；构建MDRl、GSTπ特异性siRNA真核表达载体。 方法；参照siRNA模板设计原则，设计并化学合成两条siRNA模板序
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第一部分
MI)R1、GSTⅡ特异性siRNA真核表达载体的构建
目的；构建MDRl、GSTπ特异性siRNA真核表达载体。
方法；参照siRNA模板设计原则，设计并化学合成两条siRNA模板序列，退火后将其插入质粒psilencer2．1～U6，构建重组质粒psilencer2．1-MDRl、GSTⅡ，并通过限制性酶切和基因测序进行鉴定。设置空载体作为阴性对照。
结果；重组质粒psilencer2．1一MDRl、GSTⅡ经酶切、测序分析表明siRNA模板序列成功插入预计位点，并且序列正确。
结论；成功构建了抗MDRl、GSTπmRNA的siRNA真核表达载体，为进一步研究白血病多药耐药基因的功能打下基础。
第二部分
siRNA真核表达载体诱导K562／A02凋亡及其机制的研究
目的；研究siRNA诱导K562／A02细胞凋亡及其机制的研究。
方法；siRNA重组质粒pSilence-MDRl和pSilence-GSTⅡ共转染K562／A02细胞，同时以空载体pSilencer2．1-U6转染K562／A02细胞(mock)作为对照，流式细胞仪检测细胞凋亡；MTT法检测阿霉素的半数抑制浓度(IC50)；透射电镜观察细胞超微结构变化；Westernblot检测凋亡相关蛋白Bcl-2的改变。
结果；流式细胞仪显示空载体pSilencef2,l-U6转染组(mock)细胞凋亡率为11．65-t-4．06，pSilence-MDRl和pSilence43STⅡ共转染组细胞凋亡率44．98±11．27(P<0．01)。空载体转染细胞后耐药指数为23，而pSilence-MDRl、pSilence-GSTπ共转染后耐药指数降低为7，半数抑制浓度(ICso)值从转染前(1．16_+0．38)μmol／ml下降为(0．33_+0．04)Bmol／ml(P<0．01)。透射电镜下，pSilence-MDRl和pSilence43STⅡ共转染组细胞胞浆浓缩、线粒体出现肿胀空泡样变、胞核内染色质浓集、染色质形成新月体样改变并有凋亡小体形成等典型的凋亡改变；Westernblot结果表明重组质粒共转染组发生凋亡细胞中，Bcl-2含量由0．75±0．03(mock)下降为0．524-0．11(P<0．05)。
结论；siRNA重组质粒pSilence-MDRl、pSilence-GSTⅡ可以诱导K562／ADR细胞凋亡，且通过抑制Bcl-2表达而诱导发生凋亡，对K562／ADR细胞株耐药性具有明显的下调作用。
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