分子诊断技术在目前临床微生物检测中发挥着十分重要的作用,可以通过对目标微生物DNA的体外扩增来实现对微生物的检测。不过由于临床样品中基质较为复杂,细菌丰度较低,直接使用其作为分子诊断的模板可能会导致检测结果出现假阳性或假阴性的情况。因此我们需要一种可以集分离、纯化、富集为一体的样品前处理方法来对临床样品进行处理,使处理后样品中的目标微生物纯度和丰度变高,方便后续分子诊断的检测工作。免疫磁分离技术（Immuno-Magnetic Separation,IMS）是近期新兴的一种样品前处理方法,基于免疫学分离原理,将目标微生物的抗体偶联在磁珠上形成免疫磁珠（Immonumagnetic Beads,IB）,通过磁性分离可以在复杂基质中有效的通过抗原-抗体结合的机制来分离、纯化和富集目标微生物。外膜蛋白A（Outer membrane protein A,OmpA）作为一种在大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）表面广泛存在的蛋白,将其抗体偶联到磁珠上形成IB-OmpA理论上可用于靶向识别E.coli。本研究将利用IMS技术联合分子诊断技术来建立对E.coli分子诊断样品前处理方法的应用。本文主要研究内容与结果如下:一、OmpA原核表达载体的构建与纯化:根据在NCBI上查询到的E.coli OmpA蛋白的核酸序列,使用Primer 5软件设计嵌套PCR引物。通过PCR扩增得到OmpA基因后,构建表达载体p ET-32a-OmpA。使用IPTG诱导OmpA蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白在包涵体中表达。使用8 M尿素处理包涵体蛋白,并使用亲和层析进行纯化,得到纯化的重组OmpA蛋白。二、anti-OmpA多克隆抗体的制备:将纯化得到的OmpA重组蛋白作为抗原,与弗氏佐剂混匀后免疫Balb/c小鼠,经过四次免疫之后,抽取血液分离血清。ELISA检测其效价为256000。以E.coli、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌作为抗原,评价anti-OmpA抗血清是否可用于捕获革兰氏阴性菌,结果显示anti-OmpA抗血清可检测受试的所有E.coli菌株,同时对其他受试的革兰氏阴性菌表现出一定的交叉反应,但是存在菌株的差异。三、IB-OmpA-PCR样品前处理方法的评价:将anti-OmpA多克隆抗体偶联到磁珠上（IB-OmpA）,置于含有E.coli的液体样品中,通过抗原抗体特异性结合的能力,IB-OmpA在样品中捕获E.coli。之后通过外界施加磁场将捕获物浓缩分离出来,并通过PCR技术对产物进行检验。结果表明,IB-OmpA-PCR可用于富集和检测E.coli,其检测灵敏度相较于未使用处理方法有了约100倍的提升。进一步验证显示该方法可以在各种复杂的液体基质中（血液、尿液、果汁等）实现E.coli的富集。本研究表达并纯化了OmpA重组蛋白,并用于制备anti-OmpA多克隆抗体,评价了其结合E.coli的可行性,最后联合使用IMS技术和PCR技术建立了IB-OmpA-PCR的E.coli分子诊断方法。IB-OmpA-PCR方法无需通过传统培养基培养分选微生物等方式即可快速有效的从液体基质中分离富集E.coli,在提高了检测灵敏度的同时降低了基质对检测的影响,为临床样品中E.coli的前处理方式提出了新的思路。