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一、研究背景微泡是细胞间信号传导的一种载体,包含蛋白质、mRNA、miRNAs等多种生物活性物质,在细胞的增殖、凋亡、迁移等病理生理过程中扮演重要角色。血小板是循环中微泡的主要来源,临床研究显示在冠心病、房颤等患者的循环中,微泡含量显著增加,并且和多种心血管疾病的发生发展密切相关。我们前期的研究显示,凝血酶激活血小板后产生的微泡中miRNAs的表达谱显著改变,并且可以被内皮细胞吸收,在转录后途径发挥作用。MiRNA是一种长度约为21-23个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过特异性结合mRNA序列,诱导转化或者降解mRNA,调控基因的表达。随着研究的进展,miRNA在各种病理生理过程中的调节作用越来越受到重视,并有可能成为疾病诊断的标志物和未来生物治疗的靶点。二、研究目的(1)建立完善血小板来源微泡(PMP)的分离、提取及鉴定方法,并比较漩涡震荡和凝血酶两种刺激方式对微泡及其表面膜蛋白的影响;(2)研究凝血酶刺激产生的血小板微泡对内皮细胞凋亡、迁移、活性氧(ROS)产生、一氧化氮(NO)及炎症因子分泌的作用;(3)初步探索微泡对内皮细胞中miRNAs表达的影响,及其中的miRNA对内皮细胞上述表型的作用及机制。三、研究方法(1)使用凝血酶刺激和漩涡震荡刺激血小板产生微泡,使用梯度离心法收集血小板来源的微泡,利用流式细胞仪分析微泡的大小、数量及表面的膜蛋白,透射电镜分析微泡的内在结构。(2)应用H2O2诱导脐静脉内皮细胞凋亡,应用AnnexinVFITC/PI双染检测凝血酶刺激所得微泡对内皮细胞凋亡的影响;平板划痕和Transwel l评价微泡对内皮细胞迁移能力的影响;Elisa法确定微泡对内皮细胞分泌炎症因子的影响;Griess法测定微泡对内皮细胞分泌NO的影响;ROS试剂盒结合Image J软件检测微泡对内皮细胞ROS产生的作用。(3)实时定量PCR测定微泡对内皮细胞microRNAs表达谱的改变作用。挑选其中改变最明显的microRNA进行转染,并测定其对内皮细胞上述各种表型的影响。应用双荧光素酶报告基因验证可能相对应的靶基因。四、研究结果(1)流式细胞仪鉴定显示,阿司匹林可以有效抑制血小板微泡的产生,凝血酶和漩涡震荡刺激血小板均可产生大量微泡。通过凝血酶刺激和漩涡震荡刺激并用梯度离心法可以提取纯度较高的血小板微泡。微泡膜表面的具有复杂的蛋白成分,表达多种来源于血小板的膜蛋白。漩涡震荡和凝血酶刺激获得的微泡表面CD63表达差异明显(55.38±5.27%vs 43.50±3.86%,p<0.05)。透射电镜显示微泡内部结构复杂多样,电子密度不一,包含α颗粒、糖原颗粒、线粒体等复杂成分。(2)凝血酶刺激所得血小板微泡可以促进氧化应激诱导的内皮细胞凋亡(25.59±9.50%vs 12.42±1.23%,p<0.05)、细胞内ROS的产生(0.140±0.010/pixel vs 0.109±0.010/pixel,p<0.05)及IL-1β的分泌(2.67±0.87 pg/ml vs 1.25±0.41 pg/ml,p<0.05),抑制其迁移(平板划痕:47.99±4.65%vs 61.68±2.80%,p<0.05;Transwell:123±15 vs 206±14,p<0.01)和NO的分泌(27.68±1.70μmol/L vs 34.13±1.47μmol/L,p<0.01)。(3)微泡处理内皮细胞后,细胞内miR-223(150.60±29.63 vs 1.00±0.75,p<0.001)、miR-320(20.84±18.58 vs 1.07±0.98,p<0.05)显著升高。腺病毒转染miR-223后促进了氧化应激诱导的内皮细胞凋亡(22.45±2.34%vs 12.95±0.36%,p<0.001)、抑制了其迁移(平板划痕:66.66±4.21%vs 71.59±4.02%,p<0.05;Transwel l:151±17 vs 215±29,p<0.05),但对细胞内ROS的产生、炎症因子及NO的分泌无明显影响。Targetscan软件及文献回顾预测NRF1、ATP7A、ZEB1三种miR-223的靶基因。在mRNA水平上,miR-223对内皮细胞中NRF1、ATP7A、ZEB1的表达并无显著作用。双荧光素酶报告基因显示,miR-223对NRF1 3’UTR串联的报告基因活性无明显抑制,结合位点突变后报告基因活性无明显增强。五、结论(1)血小板极易激活并产生大量表达血小板表面膜蛋白成分、大小结构不一、内容物复杂的微泡;通过梯度离心法可以提取纯度较高的血小板微泡;凝血酶刺激所得微泡表面CD63较漩涡震荡刺激所得微泡表面明显降低。(2)血小板微泡促进了氧化应激诱导的内皮细胞凋亡、ROS的产生、炎症因子的分泌,抑制了内皮细胞的迁移和NO分泌。(3)血小板微泡传递大量miR-223至内皮细胞中,并且可以通过miR-223促进内皮细胞的凋亡,抑制其迁移。NRF1不是miR-223的靶基因。