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进入21世纪后，伴随着我国社会和经济急速发展，人们生活水平的提高，生活方式改变，社会节奏的加快，我国的糖尿病患病率随之逐年升高。糖尿病已成为继肿瘤、心血管疾病以外的全球威胁人类健康的3大慢性疾病之一。长期的慢性高血糖，可引起各种急慢性并发症，糖尿病发病后的10年左右，30%～40%的人会发生至少一种并发症，而且并发症一旦产生，用药物来治疗很难逆转。长期的慢性高血糖会导致很多并发症，其中，心血管并发症是最常见而且致命的并发症之一。导致糖尿病患者死亡的第一位原因是死于心血管疾病。糖尿病所致心肌损害发病率高，死亡率高，目前尚没有有效的治疗措施。因此，对糖尿病心肌病的病理生理机制进行研究和探索，延缓疾病的发展进程，改善患者的预后，降低糖尿病心肌病心血管并发症死亡率有积极的意义。
Lin28在化学结构上属于保守的RNA结合蛋白，在生物体内发挥多种重要的生理作用，其中包括调节生物体的生长代谢，器官的发育，调节癌细胞的发生发展以及体内一些细胞的编程等方面。Lin28抑制其下游基因表达，增加葡萄糖摄取及胰岛素敏感性，在糖尿病心肌病发病中起着保护作用。哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1，Mst1)是酵母Ste20激酶在哺乳动物体内的同源蛋白，其作为Hippo信号通路的核心组件，Mst1在调节胚胎细胞生长发育、维护免疫系统稳定、细胞迁移和分化、促进细胞凋亡、抑制自噬、抑制肿瘤细胞生长等多种生理活动中发挥着及其重要作用。Mst1通过抑制自噬、促进凋亡等促进心脏功能的衰竭。Mst1敲除不仅增强自噬，而且减少凋亡，从而减轻高糖诱导的心肌损害。
尽管之前的研究发现Lin28可以选择性地抑制或阻断多种分子，抑制凋亡，减轻病理损伤性心功能障碍，抑制Mst1也可通过凋亡和自噬来发挥对心肌损害的保护。凋亡和自噬是机体重要的二大内生性机制，且相互调节、相互影响。此外，我们课题组在前期在预实验中发现，在高糖环境下，Lin28表达水平下降，Mst1表达水平上升，这也说明这二个分子是涉及糖尿病心肌病的发病机理。一方面，Lin28是否参与糖尿病心肌病的发病及保护机制尚不清楚。另一方面，在Lin28的信号通路中，Mst1是否发挥一定的作用目前仍不清楚，Lin28与Mst1是否有相互作用来发挥作用以及机制。在本研究中，我们将从Lin28是否能延缓糖尿病心肌病损害，并进一步验证Lin28和Mst1通路之间的潜在机制。为糖尿病心肌病治疗提供了一个方向。
目的:
1.构建糖尿病心肌病动物模型，分别观察Lin28转基因、Mst1敲除以及Lin28转基因伴Mst1敲除的糖尿病心肌病小鼠心脏功能、自噬、凋亡的变化。
2.分离培养原代心肌细胞，携带有Lin28a基因的腺病毒及MstlshRNA的腺病毒转染心肌细胞，观察高糖条件下，心肌细胞炎症细胞因子、线粒体形态、凋亡、自噬等水平变化。
3.原代心肌细胞过表达Lin28a及下调Mst1后给予自噬抑制剂3MA，通过免疫共定位等方法，明确Lin28a与Mst1在糖尿病心肌病中相互联系及机制。
研究方法:
1.选取6-8周龄C57小鼠、Lin28转基因小鼠、Mst1敲除小鼠以及通过杂交获得Lin28转基因+Mst1敲除小鼠，按照50mg/kg剂量的链脲佐霉素进行腹腔连续注射7d后，选择血糖为13.0mmol/L，视为1型糖尿病模型成功，纳入正式实验。1型糖尿病模型制备成功后，连续饲养8周进行下一步实验。
2.动物实验分5组：野生型组：WT组；糖尿病心肌病小鼠组(DCM)：DCM组；糖尿病心肌病Lin28转基因小鼠组：DCM+Lin28；糖尿病心肌病Mst1基因敲除小鼠组：DCM+Mst1-/-；糖尿病心肌病Lin28转基因+Mst1基因敲除小鼠组：DCM+Lin28+Mst1-/-。
3.8周末，超声检测小鼠心脏功能。
4.HE染色、Masson染色及天狼星红染色观察心肌组织病理改变。
5.Western-blot检测心肌组织中CleavedCaspase-9、P62、Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、β-actin蛋白分子表达水平。
6.培养原代心肌细胞，分为以下几组：
A.阴性对照组(5.5mmol/L葡萄糖)：Control
B.高糖对照组(25mmol/L葡萄糖):HG
C.腺病毒高糖对照组(25mmol/L葡萄糖):HG+Lin28aControlvector
D.高糖Lin28a过表达组(25mmol/L葡萄糖)：HG+Lin28a
E.腺病毒高糖对照组(25mmol/L葡萄糖):HG+Lin28aControlvector+Mst1Ad-LacZ
F.高糖Mst1下调组(25mmol/L葡萄糖)：HG+Ad-sh-Mst1+Lin28aControlvector
G.高糖Lin28a过表达+Mst1下调组(25mmol/L葡萄糖)：HG+Lin28a+Ad-sh-Mst1
7.原代心肌细胞中GFP-LC3的检测。
8.TUNEL法检测原代心肌细胞的凋亡。
9.投射电镜观察原代心肌细胞中线粒体的超微结构及自噬体数量。
10.Western-blot检测心肌细胞中Lin28a、Mst1、LC3Ⅰ/Ⅱ、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9、Beclin1、β-actin蛋白分子表达水平。
11.Lin28a与Mst1的免疫共沉淀(COIP)。
12.免疫荧光双标法(Mst1与Lin28a)。
研究结果:
1.与正常组相比，糖尿病心肌病组小鼠心脏功能减低，Lin28转基因、Mst1敲除均能改善小鼠心脏功能。
2.与正常组相比，糖尿病心肌病组小鼠自噬减低，凋亡增加。与糖尿病心肌病组相比，Lin28转基因、Mst1敲除自噬增加，凋亡减少。
3.与正常组相比，高糖组心肌细胞IL-6、TNF-α表达水平增加，ATP含量、CS水平、ComplexesⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ水平明显下降；与高糖组相比，高糖Lin28a过表达及Mst1敲除组，心肌细胞IL-6、TNF-α表达水平减少，ATP含量、CS水平、ComplexesⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ水平上升；与高糖Lin28a过表达组以及高糖Mst1敲除组相比，高糖Lin28a过表达+Mst1下调组未能进一步减少IL-6、TNF-α表达水平，未能进一步增加ATP含量、CS水平、ComplexesⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ水平。
4.高糖作用48小时后，高糖心肌细胞凋亡明显增加。过表达Lin28a、Mst1下调可以显著减少高糖引起的心肌细胞凋亡，而在Mst1敲除的心肌细胞，Lin28a过表达不能进一步降低凋亡。
5.与正常组细胞相比，高糖心肌细胞GFP-LC3的荧光颗粒减少。与高糖组相比，高糖Lin28a过表达组及高糖Mst1下调组GFP-LC3荧光颗粒增多；与高糖Lin28a过表达组、高糖Mst1下调组相比，高糖Lin28a过表达+Mst1下调组GFP-LC3荧光颗粒无明显差异。
6.Western-blot检测显示:高糖组心肌细胞P62、CleavedCaspase-3及CleavedCaspase-9蛋白裂解水平明显增加，而Bcline1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平下降。高糖Lin28过表达及高糖Mst1下调均明显减少P62、CleavedCaspase-3及CleavedCaspase-9蛋白裂解水平，Bcline1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高。高糖Lin28a过表达+Mst1下调蛋白表达水平与高糖Lin28a过表达及高糖Mst1下调组相比无明显差异。
7.高糖处理的原代心肌细胞中，线粒体出现基质肿胀和嵴断裂，表现为线粒体嵴丢失，出现空泡，自噬体数量也明显降低。在高糖Lin28a过表达及高糖Mst1下调后线粒体损伤较轻，线粒体结构异常较少，空泡较少，而自噬体数量也明显增加。但是，高糖Lin28a过表达+Mst1下调组与高糖Lin28a过表达组及高糖Mst1下调组相比均无显著差异。
8.给予3MA后，Lin28a过表达及Mst1下调所致心肌细胞凋亡减少、自噬增加的作用消失了。
9.免疫共沉淀实验表明，Flag-Mst1与Lin28a之间没有显著的相互作用。免疫荧光双标记实验显示Mst1和Lin28a之间没有共定位。
10.Lin28a过表达明显增加Akt的表达。
结论:
通过本实验，糖尿病心肌病能加重心功能障碍，加重心肌组织病理损伤，降低心肌细胞自噬、增强心肌细胞凋亡。Lin28a过表达或者Mst1敲除均可减轻线粒体超微结构损伤，降低炎症因子水平，通过增强心肌细胞的自噬流来缓解高糖诱发的心肌细胞凋亡。Lin28a改善心肌损伤作用是通过调节Mst1来实现的。Lin28a通过增强Akt表达水平来间接调节Mst1，继而发挥对心肌的保护作用。因此，Lin28a与Mst1通过调节凋亡和自噬参与糖尿病心肌病的发生和进展，是糖尿病心肌病发生发展的分子机制之一。我们的研究对糖尿病心肌病发病、保护机制及治疗指引了一个新方向。
Lin28在化学结构上属于保守的RNA结合蛋白，在生物体内发挥多种重要的生理作用，其中包括调节生物体的生长代谢，器官的发育，调节癌细胞的发生发展以及体内一些细胞的编程等方面。Lin28抑制其下游基因表达，增加葡萄糖摄取及胰岛素敏感性，在糖尿病心肌病发病中起着保护作用。哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1，Mst1)是酵母Ste20激酶在哺乳动物体内的同源蛋白，其作为Hippo信号通路的核心组件，Mst1在调节胚胎细胞生长发育、维护免疫系统稳定、细胞迁移和分化、促进细胞凋亡、抑制自噬、抑制肿瘤细胞生长等多种生理活动中发挥着及其重要作用。Mst1通过抑制自噬、促进凋亡等促进心脏功能的衰竭。Mst1敲除不仅增强自噬，而且减少凋亡，从而减轻高糖诱导的心肌损害。
尽管之前的研究发现Lin28可以选择性地抑制或阻断多种分子，抑制凋亡，减轻病理损伤性心功能障碍，抑制Mst1也可通过凋亡和自噬来发挥对心肌损害的保护。凋亡和自噬是机体重要的二大内生性机制，且相互调节、相互影响。此外，我们课题组在前期在预实验中发现，在高糖环境下，Lin28表达水平下降，Mst1表达水平上升，这也说明这二个分子是涉及糖尿病心肌病的发病机理。一方面，Lin28是否参与糖尿病心肌病的发病及保护机制尚不清楚。另一方面，在Lin28的信号通路中，Mst1是否发挥一定的作用目前仍不清楚，Lin28与Mst1是否有相互作用来发挥作用以及机制。在本研究中，我们将从Lin28是否能延缓糖尿病心肌病损害，并进一步验证Lin28和Mst1通路之间的潜在机制。为糖尿病心肌病治疗提供了一个方向。
目的:
1.构建糖尿病心肌病动物模型，分别观察Lin28转基因、Mst1敲除以及Lin28转基因伴Mst1敲除的糖尿病心肌病小鼠心脏功能、自噬、凋亡的变化。
2.分离培养原代心肌细胞，携带有Lin28a基因的腺病毒及MstlshRNA的腺病毒转染心肌细胞，观察高糖条件下，心肌细胞炎症细胞因子、线粒体形态、凋亡、自噬等水平变化。
3.原代心肌细胞过表达Lin28a及下调Mst1后给予自噬抑制剂3MA，通过免疫共定位等方法，明确Lin28a与Mst1在糖尿病心肌病中相互联系及机制。
研究方法:
1.选取6-8周龄C57小鼠、Lin28转基因小鼠、Mst1敲除小鼠以及通过杂交获得Lin28转基因+Mst1敲除小鼠，按照50mg/kg剂量的链脲佐霉素进行腹腔连续注射7d后，选择血糖为13.0mmol/L，视为1型糖尿病模型成功，纳入正式实验。1型糖尿病模型制备成功后，连续饲养8周进行下一步实验。
2.动物实验分5组：野生型组：WT组；糖尿病心肌病小鼠组(DCM)：DCM组；糖尿病心肌病Lin28转基因小鼠组：DCM+Lin28；糖尿病心肌病Mst1基因敲除小鼠组：DCM+Mst1-/-；糖尿病心肌病Lin28转基因+Mst1基因敲除小鼠组：DCM+Lin28+Mst1-/-。
3.8周末，超声检测小鼠心脏功能。
4.HE染色、Masson染色及天狼星红染色观察心肌组织病理改变。
5.Western-blot检测心肌组织中CleavedCaspase-9、P62、Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、β-actin蛋白分子表达水平。
6.培养原代心肌细胞，分为以下几组：
A.阴性对照组(5.5mmol/L葡萄糖)：Control
B.高糖对照组(25mmol/L葡萄糖):HG
C.腺病毒高糖对照组(25mmol/L葡萄糖):HG+Lin28aControlvector
D.高糖Lin28a过表达组(25mmol/L葡萄糖)：HG+Lin28a
E.腺病毒高糖对照组(25mmol/L葡萄糖):HG+Lin28aControlvector+Mst1Ad-LacZ
F.高糖Mst1下调组(25mmol/L葡萄糖)：HG+Ad-sh-Mst1+Lin28aControlvector
G.高糖Lin28a过表达+Mst1下调组(25mmol/L葡萄糖)：HG+Lin28a+Ad-sh-Mst1
7.原代心肌细胞中GFP-LC3的检测。
8.TUNEL法检测原代心肌细胞的凋亡。
9.投射电镜观察原代心肌细胞中线粒体的超微结构及自噬体数量。
10.Western-blot检测心肌细胞中Lin28a、Mst1、LC3Ⅰ/Ⅱ、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9、Beclin1、β-actin蛋白分子表达水平。
11.Lin28a与Mst1的免疫共沉淀(COIP)。
12.免疫荧光双标法(Mst1与Lin28a)。
研究结果:
1.与正常组相比，糖尿病心肌病组小鼠心脏功能减低，Lin28转基因、Mst1敲除均能改善小鼠心脏功能。
2.与正常组相比，糖尿病心肌病组小鼠自噬减低，凋亡增加。与糖尿病心肌病组相比，Lin28转基因、Mst1敲除自噬增加，凋亡减少。
3.与正常组相比，高糖组心肌细胞IL-6、TNF-α表达水平增加，ATP含量、CS水平、ComplexesⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ水平明显下降；与高糖组相比，高糖Lin28a过表达及Mst1敲除组，心肌细胞IL-6、TNF-α表达水平减少，ATP含量、CS水平、ComplexesⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ水平上升；与高糖Lin28a过表达组以及高糖Mst1敲除组相比，高糖Lin28a过表达+Mst1下调组未能进一步减少IL-6、TNF-α表达水平，未能进一步增加ATP含量、CS水平、ComplexesⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ水平。
4.高糖作用48小时后，高糖心肌细胞凋亡明显增加。过表达Lin28a、Mst1下调可以显著减少高糖引起的心肌细胞凋亡，而在Mst1敲除的心肌细胞，Lin28a过表达不能进一步降低凋亡。
5.与正常组细胞相比，高糖心肌细胞GFP-LC3的荧光颗粒减少。与高糖组相比，高糖Lin28a过表达组及高糖Mst1下调组GFP-LC3荧光颗粒增多；与高糖Lin28a过表达组、高糖Mst1下调组相比，高糖Lin28a过表达+Mst1下调组GFP-LC3荧光颗粒无明显差异。
6.Western-blot检测显示:高糖组心肌细胞P62、CleavedCaspase-3及CleavedCaspase-9蛋白裂解水平明显增加，而Bcline1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平下降。高糖Lin28过表达及高糖Mst1下调均明显减少P62、CleavedCaspase-3及CleavedCaspase-9蛋白裂解水平，Bcline1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高。高糖Lin28a过表达+Mst1下调蛋白表达水平与高糖Lin28a过表达及高糖Mst1下调组相比无明显差异。
7.高糖处理的原代心肌细胞中，线粒体出现基质肿胀和嵴断裂，表现为线粒体嵴丢失，出现空泡，自噬体数量也明显降低。在高糖Lin28a过表达及高糖Mst1下调后线粒体损伤较轻，线粒体结构异常较少，空泡较少，而自噬体数量也明显增加。但是，高糖Lin28a过表达+Mst1下调组与高糖Lin28a过表达组及高糖Mst1下调组相比均无显著差异。
8.给予3MA后，Lin28a过表达及Mst1下调所致心肌细胞凋亡减少、自噬增加的作用消失了。
9.免疫共沉淀实验表明，Flag-Mst1与Lin28a之间没有显著的相互作用。免疫荧光双标记实验显示Mst1和Lin28a之间没有共定位。
10.Lin28a过表达明显增加Akt的表达。
结论:
通过本实验，糖尿病心肌病能加重心功能障碍，加重心肌组织病理损伤，降低心肌细胞自噬、增强心肌细胞凋亡。Lin28a过表达或者Mst1敲除均可减轻线粒体超微结构损伤，降低炎症因子水平，通过增强心肌细胞的自噬流来缓解高糖诱发的心肌细胞凋亡。Lin28a改善心肌损伤作用是通过调节Mst1来实现的。Lin28a通过增强Akt表达水平来间接调节Mst1，继而发挥对心肌的保护作用。因此，Lin28a与Mst1通过调节凋亡和自噬参与糖尿病心肌病的发生和进展，是糖尿病心肌病发生发展的分子机制之一。我们的研究对糖尿病心肌病发病、保护机制及治疗指引了一个新方向。